Molecular Markers of Antimalarial Resistance in Children with Uncomplicated Plasmodium falciparum at Two Sites in Liberia in 2022-2023

技術要約：リベリアの2地点における無症候性熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）感染児における抗マラリア薬耐性の分子マーカー（2022年-2023年）

問題の所在
マラリアはリベリアにおいて依然として重要な罹患および死亡の原因であり、同国では熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）が主要な種となっている。アルテミシニン併用療法（ACT）が標準治療として用いられているが、その有効性は薬剤耐性の出現によって脅かされている。リベリアにおける過去の研究では、アルテスナート・アモジアキイン（ASAQ）の有効性の低下が示されており、これに伴い第一選択薬がアルテメテル・ルメファントリン（AL）へと変更された。しかし、ACTの継続的な有効性を確保し、アルテミシニン誘導体およびパートナー薬に対する耐性の初期兆候を検出するためには、継続的なモニタリングが必要である。本研究は、リベリアにおける抗マラリア薬耐性に関連する検証済みおよび候補となる遺伝的マーカーの有病率を特徴付けるための、分子サーベイランスの必要性に対処するものである。

方法論
本研究は、2022年8月から2023年7月にかけて、2つの農村部センチネルサイト（サクレペア：ニンバ郡、およびシンジェ：グランド・ケープ・マウント郡）で実施された治療有効性試験（TES）から収集された検体を用いた、回顧的な分子解析である。

• 対象集団： 無症候性のP. falciparum単一感染症を有する352名の小児（年齢6ヶ月から5歳）が登録された。彼らはALまたはASAQによる治療を受け、28日間の経過観察が行われた。
• 検体採取： 再発した寄生虫血症を認めた参加者について、Day 0（D0）および治療失敗時（DoF）に乾燥血液スポット（DBS）が採取された。
• 検体処理： 受領された328個のDBS検体のうち、目視によるカビの発生が認められた71個のサンプルを除外した後、255個が品質基準を満たした。91個のサンプル（すべてのペアとなるD0/DoFサンプルおよび、ランダムに選択された81個の非ペアD0サンプル）からDNAを抽出した。
• 分子解析：
  • 種確定： マルチプレックス・リアルタイムPCR（PET-PCR）アッセイにより、90個のサンプルにおいてP. falciparum単一感染であることを確認した。
  • シーケンシング： 6つの耐性関連遺伝子（Pfk13, Pfmdr1, Pfcrt, Pfdhfr, Pfdhps, Pfcytb）の全長増幅を、マラリア耐性サーベイランス（Maars）次世代シーケンシング（NGS）プロトコルを用いて実施した。
  • データ処理： シーケンシングはIllumina MiSeqプラットフォーム上で実施された。データは、最小品質スコア35および最低リード数5を基準として、単一塩基多型（SNP）を特定するためにNf-NeSTパイプラインを用いて処理された。多型部位については、加重バリアントアレル頻度（VAF）が算出された。

主な結果

• アルテミシニン耐性（Pfk13）： 正常にシーケンシングされた87個のサンプルにおいて、アルテミシニン部分的耐性と関連する検証済みまたは候補となる変異は、Pfk13プロペラ領域において検出されなかった。
• スルファドキシン・ピリメタミン（SP）耐性（Pfdhfr/Pfdhps）：
  • Pfdhfr： 変異N51I、C59R、およびS108Nが検出された。シンジェでは、これら3つの変異がいずれも固定（100%）されていた。サクレペアでは、それぞれの頻度は68%、86%、93%であった。
  • Pfdhps： 変異I431V、S436A、A437G、K540E、A581G、およびA613Sが観察された。クインテット・ハプロタイプの一部であるK540E変異は、両地点を通じて13–16%で見られた。ダブルステップ・ハプロタイプであるA581G変異は、シンジェでのみ（9.2%）検出された。
  • 結論： Pfdhfrの変異率はWHOの閾値を超えていたものの、Pfdhpsの変異率（特にK540EおよびA581G）は、SPの有効性が損なわれていると定義する50%の閾値を下回っていた。
• ルメファントリンおよびアモジアキイン耐性（Pfmdr1）：
  • 野生型N86アレルが優勢であった（N86Yの頻度はサクレペアで5.5%、シンジェで0.83%）。
  • Y184F変異は中程度の割合で観察された（サクレペアで51%、シンジェで41%）。
  • D1246Y変異は稀であった（シンジェで0.71%）。
  • 野生型のNYDハプロタイプが最も多く、次いで単一変異を持つNFDハプロタイプが多かった。
• クロロキン/アモジアキイン耐性（Pfcrt）：
  • 標準的なクロロキン耐性変異（M74I、N75E、K76T）が、サクレペアのサンプルの12%、およびシンジェのサンプルの22%で検出された。
  • 変異型CVIETハプロタイプは、サクレペアで12%、シンジェで17%で見られた。
  • 特筆すべき点として、2例のASAQ治療失敗（再発サンプル）において、ベースライン時の野生型CVMNKから、治療失敗時の変異型CVIETハプロタイプへのシフトが認められた。一方で、ALの失敗例は野生型のままであった。
• アトバクオン耐性（Pfcytb）： 正常にシーケンシングされた89個のサンプルにおいて、アトバクオン耐性に関連する変異は特定されなかった。

意義および主張
著者らは、本研究がリベリアにおける抗マラリア薬耐性マーカーの包括的な分子特性化を提供しており、同地域におけるACTの高い有効性を支持するものであると主張している。

1. アルテミシニンの感受性： Pfk13変異の不在は、アルテミシニン部分的耐性が研究地点において出現していないことを示している。
2. SPの有用性： Pfdhfrの変異率が高いにもかかわらず、重要なPfdhps変異の低頻度性は、SPの広範な耐性の証拠がないことを示唆しており、間欠的予防投与としてのSPの継続的な使用を支持している。
3. ALの有効性： Pfmdr1およびPfcrtの分子プロファイルは、ALの継続的な有効性と一致している。野生型N86アレルの優勢およびD1246Yの低頻度は、寄生虫集団がAL治療に対して適合した状態にあることを示唆している。
4. ASAQの低下： 本研究は、以前に観察されたASAQの有効性低下に対して分子的な説明を提供しており、アモジアキインによる選択圧と一致するCVIETハプロタイプの選択を指摘している。
5. サーベイランスの価値： NGSベースの分子サーベイランスと治療有効性モニタリングの統合は、国家的な治療政策への情報提供およびマラリア管理戦略の指針となるための重要なツールとして強調されている。

本論文は、循環している寄生虫集団がY184Fの頻度によりルメファントリン感受性の低下に対して脆弱である可能性があるものの、現在のデータはリベリアにおける第一選択療法としてのALの継続使用を支持していると結論付けている。著者らは、これらの傾向を監視するための持続的なゲノムサーベイランスの必要性を強調している。