Impact of Extraction Time on Caffeine Content, Antioxidant, and Antidiabetic Properties of Guatemalan and Honduran Coffees: An In Vitro and Computational Study

Resumen Técnico: Impacto del Tiempo de Extracción en el Contenido de Cafeína, Propiedades Antioxidantes y Antidiabéticas de Cafés de Guatemala y Honduras

Planteamiento del Problema
Los trastornos metabólicos, particularmente la Diabetes Tipo 2 (DT2), representan una carga significativa para la salud global. Si bien se utilizan ampliamente los fármacos convencionales, estos suelen estar asociados con efectos secundarios adversos, lo que impulza el interés en los compuestos bioactivos naturales. El café es un candidato prometedor debido a su rico perfil de fitoquímicos, que incluyen cafeína, ácidos fenólicos y melanoidinas, los cuales exhiben actividades antioxidantes y de modulación enzimática. Sin embargo, la concentración de estos compuestos bioactivos en la bebida final no es intrínseca al grano crudo, sino que está críticamente determinada por los parámetros de procesamiento, específicamente el tiempo de extracción. Mientras que una extracción prolongada puede mejorar el rendimiento de los fenoles, también puede conducir a la degradación de moléculas lábiles. Actualmente, el impacto específico de los tiempos de extracción acuosa prolongados sobre el contenido de cafeína y las concomitantes propiedades antioxidantes y antidiabéticas de las infusiones de café de Sudamérica permanece insuficientemente caracterizado. Este estudio aborda esta brecha evaluando sistemáticamente los tiempos de extracción de 24, 48 y 72 horas.

Metodología
El estudio utilizó granos de café tostados de Guatemala y Honduras, recolectados en Durban, Sudáfrica. Los granos fueron tostados a 150 °C durante 15 minutos, molidos y sometidos a extracción acuosa utilizando agua destilada hirviendo (relación 1:10 p/v) durante 24, 48 y 72 horas. Los extractos resultantes fueron liofilizados y reconstituidos para su análisis.

El flujo de trabajo experimental incluyó:

1. Caracterización Fitoquímica: Cuantificación del Contenido de Fenoles Totales (CFT) y el Contenido de Flavonoides Totales (CFT) mediante ensayos espectrofotométicos (Folin–Ciocalteu y métodos de cloruro de aluminio).
2. Perfil Químico: Se empleó Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS) para identificar constituyentes volátiles y semivolátiles y cuantificar la abundancia relativa de la cafeína.
3. Ensayos de Bioactividad In Vitro:
   • Capacidad Antioxidante: Evaluada mediante ensayos de eliminación de radicales DPPH, Poder Reductor de Hierro (FRAP) y de eliminación de Óxido Nítrico (NO).
   • Potencial Antidiabético: Evaluado mediante la inhibición de enzimas digestivas de carbohidratos, específicamente la $\alpha$-amilasa y la $\alpha$-glucosidasa.
4. Estudios Computacionales: Para elucidar los mecanismos moleculares, el estudio empleó:
   • Acoplamiento Molecular (Molecular Docking): Utilizando Schrödinger Maestro para analizar la afinidad de unión de la cafeína (el principal compuesto bioactivo identificado) a la $\alpha$-glucosidasa y la $\alpha$-amilasa.
   • Simulaciones de Dinámica Molecular (MD): Realizadas durante 100 ns para evaluar la estabilidad de los complejos cafeína-enzima utilizando métricas como la Desviación de la Raíz Cuadrática Media (RMSD), la Fluctuación de la Raíz Cuadrática Media (RMSF), el Área de Superficie Accesible al Solvente (SASA) y el Radio de Giro (RoG).
   • Análisis MM-GBSA: Se calcularon las energías libres de unión ($\Delta G_{bind}$) para cuantificar las fuerzas impulsoras termodinámicas.

Resultados Clave

• Rendimiento Fitoquímico: El tiempo de extracción prolongado aumentó significamente el rendimiento de los compuestos bioactivos. Los extractos de 72 horas contenían las proporciones más altas de CFT y CFT. Específicamente, el extracto hondureño de 72 horas produjo el 52% del CFT total y el 59% del CFT total, mientras que el extracto guatemalteco de 72 horas produjo el 49% y el 47%, respectivamente.
• Perfil Químico: El análisis de GC-MS confirmó un aumento progresivo en la abundancia de cafeína con tiempos de extracción más largos. La abundancia relativa de cafeína en el café guatemalteco aumentó de 74.65 (24h) a 91.79 (72h), y en el café hondureño de 91.99 (24h) a 94.51 (72h). Los extractos de 72 horas también exhibieron los perfiles químicos más complejos, con identificaciones de compuestos únicos no presentes en tiempos de extracción más cortos.
• Actividad Antioxidante: Todos los extractos demostraron una potente actividad dependiente de la concentración. Los extractos de 72 horas exhibieron consistentemente la actividad más fuerte (valores de IC50 más bajos) en los ensayos DPPH, FRAP y NO. Notablemente, los extractos de café de 72 horas mostraron una capacidad antioxidante significativamente más fuerte que los estándares de cafeína pura, lo que sugiere un efecto sinérgico entre la cafeína y otros compuestos fenólicos.
• Inhibición Enzimática: Se observó una tendencia clara de aumento en la potencia inhibitoria contra la $\alpha$-amilasa y la $\alpha$-glucosidasa con tiempos de extracción más largos. El extracto hondureño de 72 horas alcanzó un IC50 de 0.98 µg/mL para la $\alpha$-glucosidasa, superando al estándar farmacéutico acarbosa (1.74 µg/mL). Del mismo modo, los extractos de 72 horas para ambos orígenes mostraron una inhibición comparable o superior de la $\alpha$-amilasa en relación con la acarbosa.
• Validación Computacional: El acoplamiento molecular reveló fuertes afinidades de unión de la cafeína a ambas enzimas ($\Delta G$ de -5.26 kcal/mol para $\alpha$-glucosidasa y -5.98 kcal/mol para $\alpha$-amilasa). Las simulaciones de MD confirmaron la estabilidad de estos complejos durante 100 ns, con valores bajos de RMSD y RoG que indican integridad estructural. Los cálculos de MM-GBSA arrojaron energías libres de unión favorables (por ejemplo, -32.94 kcal/mol para cafeína-$\alpha$-amilasa a los 100 ns), impulsadas principalmente por interacciones de van der Waals y lipofílicas.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores afirman que este estudio proporciona la primera evidencia de que la extracción acuosa prolongada (específicamente 72 horas) optimiza la liberación de contenidos de cafeína, polifenoles y flavonoides en cafés de Sudamérica, maximizando así sus propiedades antioxidantes y antidiabéticas in vitro. La investigación establece una relación directa estructura-actividad donde la cafeína bioactiva enriquecida por la extracción prolongada actúa como un inhibidor dual estable y de alta afinidad de las enzimas metabólicas clave.

El estudio concluye que el tiempo de extracción es un parámetro operativo crítico que modula los beneficios funcionales del café. Al vincular la extracción prolongada con una bioactividad mejorada y validarlo mediante enfoques integrados in vitro y computacionales, el artículo sugiere que los protocolos de preparación optimizados podrían mejorar el papel del café como un coadyuvante dietético para el manejo de la salud metabólica, específicamente la DT2. Los autores señalan que, si bien estos hallazgos son prometedores, se requiere investigación futura para validar estos resultados en modelos in vivo.