Optimization of the 5' untranslated region and codon of the mRNA vaccines

Resumen Técnico: Optimización de la región 5' no traducida y del codón de las vacunas de ARNm

Planteamiento del problema
Las vacunas de ARN mensajero (ARNm) ofrecen ventajas significativas en cuanto a velocidad de desarrollo y flexibilidad de objetivos en comparación con las plataformas convencionales. Sin embargo, su eficacia clínica se ve a menudo limitada por desafíos relacionados con la inestabilidad del ARNm, la eficiencia de la traducción y la inmunogenicidad. La región 5' no traducida (5'UTR) y la secuencia codificante (ORF) son determinantes críticos de la estabilidad del transcrito y la eficiencia de la traducción. Específicamente, el estudio señala que, si bien se utilizan comúnmente 5'UTR naturales (como la α-globina humana), estas pueden no funcionar eficazmente bajo ciertas condiciones de fabricación (por ejemplo, el caperuza enzimática), debido potencialmente a estructuras secundarias. Además, la presencia de codones raros y estructuras secundarias excesivas en la región codificante puede impedir la traducción. Existe una necesidad de estrategias de optimización sistemáticas que mejoren la expresión de proteínas asegurando al mismo tiempo la compatibilidad entre diferentes métodos de síntesis de ARNm.

Metodología
El estudio empleó un enfoque sistemático para optimizar dos elementos clave del ARNm: la 5'UTR y el uso de codones de la región codificante.

1. Optimización de codones:

   • Estrategia: Se sustituyeron los codones sinónimos basándose en el sesgo de uso de codones humanos, reemplazando codones de baja frecuencia por otros de alta frecuencia.
   • Restricciones: La optimización mantuvo el contenido de GC entre el 56% y el 63%, evitó secuencias repetitivas largas (controladas dentro de 30 pb) y minimizó las estructuras secundarias de alta energía libre.
   • Sistema reportero: Se diseñaron y compararon dos variantes de luciferasa con codones optimizados (R008 y R009) frente a la de tipo silvestre (wild-type) y un control optimizado comercialmente (R004).

2. Optimización de la 5'UTR:

   • Identificación del problema: Los datos preliminares mostraron que la 5'UTR de la α-globina humana de tipo silvestre resultaba en una expresión insignificante cuando se utilizaba el caperuza enzimática (5'GGG), atribuido a una tasa de caperuza del 0% probablemente causada por la estructura secundaria.
   • Diseño: Se diseñaron diez nuevas secuencias de 5'UTR para alterar las estructuras secundarias y la energía libre.
   • Cribado: Se seleccionaron tres secuencias candidatas y se probaron utilizando dos métodos de transcripción distintos: caperuza enzimática (5'GGG) y caperuza CleanCap (5'AG).
   • Evaluación: La expresión se evaluó in vitro (células 293T) e in vivo (ratones BALB/c) mediante ensayos de luciferasa e imágenes de bioluminiscencia a las 6, 24 y 48 horas post-transfección.

3. Validación con la vacuna de RSV:

   • Para validar la estrategia de optimización, se construyeron dos vacunas de ARNm que codifican la proteína F del Virus Sincitial Respiratorio (RSV).
   • Estos constructos utilizaron la secuencia de codones optimizada y la 5'UTR seleccionada (Secuencia No. 2).
   • La expresión se verificó mediante Western Blot usando un HA-tag en células 293T.

Resultos clave

• Optimización de codones: Ambas variantes de luciferasa con codones optimizados (R008 y R009) demostraron niveles de expresión de proteína significativamente superiores al ARNm de tipo silvestre. La variante R009 mostró los niveles de expresión más altos en múltiples puntos temporales, superando al control comercial (R004) in vivo.
• Optimización de la 5'UTR:
  • La 5'UTR de la α-globina silvestre (5.0/7.0) no produjo una expresión significativa con la caperuza enzimática.
  • Entre las secuencias optimizadas, la "No. 2" (Secuencias 5.2 y 7.2) exhibió una aplicabilidad estable en ambos métodos de transcripción, enzimático y CleanCap.
  • Los modelos de ratón in vivo mostraron que la Secuencia 5.2 funcionó mejor con la caperuza enzimática, mientras que la Secuencia 7.2 (CleanCap) mostró una expresión ligeramente inferior pero aún funcional en comparación con la de tipo silvestre.
  • El estudio observó que el método CleanCap generalmente produjo mejores resultados que la caperuza enzimática para las secuencias probadas.
• Validación de la vacuna de RSV: Las vacunas de ARNm optimizadas que codifican la proteína F de RSV (VB2 y VB3) exhibieron una expresión de proteína significativamente mejorada en comparación con la de tipo silvestre a las 24 y 48 horas post-transfección. Se observó un efecto dependiente de la dosis, y se notaron diferencias mínimas entre las dos variantes optimizadas, confirmando la robustez de la estrategia.

Significancia y Reivindicaciones
El artículo sostiene que la estrategia de optimización identificada —que combina la optimización de codones basada en el sesgo del huésped y las restricciones de contenido de GC con diseños específicos de 5'UTR— posee un potencial significativo para la aplicación práctica en el desarrollo de vacunas de ARNm. El estudio demuestra que:

1. La optimización sistemática de codones aumenta significativamente la eficiencia de la traducción.
2. Secuencias específicas de 5'UTR (específicamente la variante "No. 2" identificada) pueden superar las limitaciones asociadas con las UTR naturales y los diferentes métodos de caperuza, ofreciendo una solución más universal.
3. Esta estrategia combinada mejora eficazmente la expresión de antígenos terapéuticos, según lo validado por el modelo de la proteína F de RSV.

Los autores concluyen que estos hallazgos proporcionan información valiosa para la producción y el diseño posteriores de vacunas de ARNm, sugiriendo que este enfoque puede aplicarse ampliamente para mejorar la eficacia de las terapias basadas en ARNm.