In utero hyperthermia impacts the histological and transcriptomic signature of the mammary fat pad of newborn heifers

Resumen Técnico: La hipertermia in utero impacta la firma histológica y transcriptómica del tejido adiposo mamario de novillas recién nacidas

Planteamiento del problema
El desarrollo de la glándula mamaria es un proceso continuo iniciado in utero, que depende de interacciones coordinadas entre el parénquima rico en epitelio (mPAR) y el tejido adiposo mamario circundante (mFP). Si bien el mFP es reconocido como un depósito metabólicamente activo que proporciona soporte estructural, reservas de lípidos y señalización paracrina esencial para la morfogénesis epitelial, el impacto específico de los estresores ambientales maternos en el desarrollo del mFP sigue siendo poco explorado. Investigaciones previas han establecido que el estrés térmico (HS, por sus siglas en inglés) materno durante la gestación afecta negativamente al mPAR, resultando en una reducción de la proliferación epíteleal, la alteración de las vías de señalización y una disminución del rendimiento de leche en la primera lactancia. Sin embargo, las consecuencias histológicas y transcriptómicas específicas del estrés térmico in utero sobre el desarrollo de los adipocitos del mFP, el metabolismo de los lípidos y los mecanismos de comunicación célula-célula en novillas recién nacidas no han sido caracterizadas.

Metodología
Este estudio utilizó un diseño experimental controlado con vacas Holstein multiparas en una granja comercial en un entorno subtropical. Las vacas fueron asignadas a uno de dos tratamientos durante los últimos 54 días de gestación:

1. Estrés Térmico (HS): Alojadas sin enfriamiento activo, experimentando un Índice de Temperatura y Humedad (THI) promedio de 79, con tasas de respiración de 79 respiraciones/min.
2. Enfriadas (CL): Alojadas con abatimiento de calor activo (ventiladores y aspersores de agua), manteniendo condiciones de termoneutralidad (rango de THI 75–83, pero con tasas de respiración fisiológica de 54 respiraciones/min).

Al nacer, se sacrificaron novillas hembras ($n=8$ por grupo) y se recolectó tejido del tejido adiposo mamario (mFP) antes de la alimentación con calostro. El estudio empleó dos enfoques analíticos primarios:

• Evaluación Histológica: Se realizaron cortes de tejido teñidos con Tricrómico de Masson. El tamaño y el número de adipocitos se cuantificaron utilizando un flujo de trabajo de imagen estandarizado (Adiposoft para ImageJ) a través de toda la sección del tejido para minimizar el sesgo de muestreo. Los adipocitos se clasificaron por área (200–8000 µm²) para analizar los cambios en la distribución.
• Análisis Transcriptómico: Se extrajo ARN de las muestras de mFP y se secuenció utilizando la plataforma Illumina NovaSeq 6000 (lecturas de extremos emparejados de 150 pb). Tras el control de calidad y la exclusión de cuatro muestras con perfiles de expresión dispersos, el análisis final incluyó $n=6$ por grupo. La expresión diferencial se evaluó mediante DESeq2 (FDR ≤ 0.05, |log₂ fold-change| ≥ 1.5). Se utilizó el Análisis de Vías de Ingenuity (IPA) para identificar las vías enriquecidas y los reguladores upstream basados en genes nominalmente significativos (NSG).

Resultados Clave

• Alteraciones Histológicas: Las novillas expuestas al HS in utero exhibieron un cambio significativo en la distribución del tamaño de los adipocitos en comparación con sus contrapartes enfriadas. El grupo HS mostró un mayor porcentaje de adipocitos pequeños (específicamente en el rango de 400–600 µm², $P=0.04$) y un menor porcentaje de adipocitos grandes (rangos 1600–2800 µm² y 5000–5200 µm², $P \le 0.09$). Esto sugiere una interrupción en la hipertrofia normal de los adipocitos.
• Cambios Transcriptómicos: El análisis identificó 122 genes expresados diferencialmente (DEG) en el mFP de las novillas con HS (40 sobreexpresados, 82 subexpresados).
  • Genes Subexpresados: Asociados principalmente con el metabolismo de lípidos (ej. ACACA, GPAM), actividad mitocondrial (PPARGC1A) y diferenciación de adipocitos.
  • Genes Sobreexpresados: Asociados con la señalización y la regulación del citoesqueleto (ej. PRKKA, GNB1, PLD2).
• Análisis de Vías y Reguladores: El IPA reveló que 60 vías se vieron significativamente impactadas, con 58 predichas como inhibidas. Estas incluyeron el metabolismo de ácidos grasos (metabolismo de la carnitina, biosíntesis de ácidos grasos), la comunicación celular (uniones gap, señalización de la GTPasa Rho) y cascadas intracelulares (PI3K/AKT, MAPK).
  • Reguladores Upstream: Se predijo la inhibición de 15 reguladores, incluyendo el Receptor de Estrógeno Alfa (ESR1), el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y FOXO1. Por el contrario, se predijo la activación de microRNAs específicos que regulan el metabolismo (ej. mir-802, mir-145-5p).
  • Vías de Señalización: Se observó una regulación a la baja en vías relacionadas con factores de crecimiento (VEGF, HGF, NGF) y señalización de insulina (translocación de GLUT4).

Contribuciones Clave
Este estudio proporciona la primera caracterización integral de la respuesta microestructural y transcriptómica del mFP a la hipertermia prenatal en bovinos. Demuestra que el estrés térmico in utero no solo reduce el peso del mFP, sino que altera fundamentalmente la composición celular y el perfil de expresión génica del tejido al nacer. Específicamente, la investigación vincula el estrés térmico materno con:

1. Un cambio hacia adipocitos más pequeños y menos diferenciados.
2. Una supresión coordinada de la lipogénesis y el metabolismo oxidativo mitocondrial.
3. La regulación a la baja de vías de señalización críticas (IGF-1, EGF, Estrógeno) y mecanismos de remodelación de la matriz extracelular que son esenciales para apoyar el crecimiento epitelial.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores sostienen que estos hallazgos indican una "supresión coordinada de la diferenciación celular, el metabolismo de lípidos, la detección de hormonas/nutrientes y la adaptación al estrés" dentro del mFP. El estudio postula que estas interrupciones tempranas en el desarrollo adiposo pueden comprometer la capacidad del mFP para servir como reserva metabólica y centro de señalización, limitando así el soporte energético y paracrino disponible para la futura expansión del parénquima mamario.

El artículo concluye que, si bien el vínculo directo con el rendimiento de la lactancia a largo plazo requiere mayor investigación, los cambios moleculares y histológicos observados proporcionan un contexto transcripcional para las reducciones previamente reportadas en el desarrollo de la glándula mamaria y el rendimiento de la leche en novillas expuestas al estrés térmico in utero. Los autores enfatizan que estos resultados resaltan al mFP como un objetivo sensible para la programación ambiental, sugiriendo que los efectos negativos del estrés térmico sobre el potencial de lactancia están arraigados en las perturbaciones del desarrollo temprano del entorno estromal. El estudio hace un llamado a futuras investigaciones que integren sistemas de co-cultivo y transcriptómica espacial para elucidar los mecanismos específicos de la comunicación cruzada epitelio-estroma interrumpida por el estrés térmico prenatal.