In utero hyperthermia impacts the histological and transcriptomic signature of the mammary fat pad of newborn heifers

技術要約：子宮内高体温が新生仔ヘイファーの乳腺脂肪組織の組織学的およびトランスクリプトーム的シグネチャーに及ぼす影響

問題提起
乳腺の発達は、子宮内で開始される継続的なプロセスであり、上皮に富む実質（mPAR）と、それを取り囲む乳腺脂肪組織（mFP）との間の協調的な相互作用に依存している。mFPは、構造的支持、脂質貯蔵、および上皮の形態形成に不可欠なパラクリンシグナルを提供する代謝活性の高い貯蔵庫として認識されているが、母体の環境ストレスがmFPの発達に与える具体的な影響については、未だ十分に解明されていない。先行研究では、妊娠中の母体の熱ストレス（HS）がmPARに悪影響を及ぼし、その結果、上皮の増殖減少、シグナル伝達経路の変化、および初産時の乳量減少をもたらすことが確立されている。しかし、新生仔ヘイファーにおける、子宮内の熱ストレスがmFPのアディポサイト（脂肪細胞）発達、脂質代謝、および細胞間シグナル伝達メカニズムに及ぼす具体的な組織学的およびトランスクリプトーム的な帰結については、これまで特徴付けられてこなかった。

方法論
本研究では、亜熱帯環境の商業農場における多産性のホルスタイン牛を用いた制御された実験デザインを用いた。牛は妊娠の最後の54日間において、以下の2つの処置のいずれかに割り当てられた：

1. 熱ストレス群（HS）： 能動的な冷却なしで飼育され、温度湿度指数（THI）は平均79、呼吸数は79回/分であった。
2. 冷却群（CL）： 能動的な熱緩和策（ファンおよびウォータースプリンクラー）を用いて飼育され、熱中性条件（THI 75–83の範囲であるが、生理学的呼吸数は54回/min）を維持した。

出生時、雌のヘイファー（$n=8$ per group）を安楽死させ、初乳の給餌前に乳腺脂肪組織（mFP）を採取した。本研究では、主に以下の2つの解析アプローチを採用した：

• 組織学的評価： 組織切片をマッソン・トリクローム染色した。サンプリングバイアスを最小限に抑えるため、組織切片全体にわたって標準化されたイメージングパイプライン（ImageJ用のAdiposoft）を用い、アディポサイトのサイズと数を定量化した。分布の変化を分析するために、アディポサイトを面積（200–8000 µm²）ごとに分類した。
• トランスクリプトーム解析： mFPサンプルからRNAを抽出し、Illumina NovaSeq 6000プラットフォーム（150 bp ペアエンドリード）を用いてシーケンシングを行った。品質管理および発現プロファイルが乏しい4つのサンプルを除外した後、最終的な解析には$n=6$ per groupを用いた。発現変動解析にはDESeq2（FDR ≤ 0.05, |log₂ fold-change| ≥ 1.5）を用い、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）を使用して、名目上有意な遺伝子（NSG）に基づく濃縮されたパスウェイおよびアップストリームレギュレーターを特定した。

主な結果

• 組織学的変化： 子宮内の熱ストレス（HS）に曝露されたヘイファーは、冷却群と比較してアディポサイトのサイズ分布において有意なシフトを示した。HS群は、より小さなアディポサイト（特に400–600 µm²の範囲、$P=0.04$）の高い割合を示し、大きなアディポサイト（1600–2800 µm²および5000–5200 µm²の範囲、$P \le 0.09$）の割合が低かった。これは、正常なアディポサイトの肥大化が阻害されていることを示唆している。
• トランスクリプトームの変化： 解析により、HS群のヘイファーのmFPにおいて122個の変動発現遺伝子（DEG）が特定された（アップレギュレートされたものが40個、ダウンレギュレートされたものが82個）。
  • ダウンレギュレートされた遺伝子： 主に脂質代謝（例：ACACA, GPAM）、ミトコンドリア活性（例：PPARGC1A）、およびアディポサイト分化に関連していた。
  • アップレギュレートされた遺伝子： シグナル伝達および細胞骨格の調節に関連していた（例：PRKACA, GNB1, PLD2）。
• パスウェイおよびレギュレーター解析： IPAにより60のパスウェイが有意に影響を受けていることが判明し、そのうち58個が抑制されると予測された。これらには、脂肪酸代謝（カルニチン代謝、脂肪酸合成）、細胞コミュニケーション（ギャップ結合、Rho GTPaseシグナル伝達）、および細胞内カスケード（PI3K/AKT、MAPK）が含まれる。
  • アップストリームレギュレーター： 15のレギュレーターが抑制されると予測された。これには、エストロゲン受容体アルファ（ESR1）、上皮成長因子（EGF）、およびFOXO1が含まれる。逆に、代謝を調節する特定のマイクロRNA（例：mir-802, mir-145-5p）は活性化されると予測された。
  • シグナル伝達経路： 成長因子（VEGF, HGF, NGF）およびインスリンシグナル（GLUT4転位）に関連するパスウェイにおいてダウンレギュレーションが観察された。

主な貢献
本研究は、牛の子宮内高体温に対するmFPの微細構造およびトランスクリプトーム的応答に関する初の包括的な特徴付けを提供するものである。本研究は、子宮内の熱ストレスが単にmFPの重量を減少させるだけでなく、出生時における組織の細胞組成および遺伝子発現プロファイルを根本的に変化させることを示している。具体的には、本研究は母体の熱ストレスと以下の事項を結びつけている：

1. より小さく、分化が進んでいないアディポサイトへのシフト。
2. リポジェネシス（脂質生成）およびミトコンドリア酸化代謝の協調的な抑制。
3. 上皮の成長を支えるために不可欠な、重要なシグナル伝達経路（IGF-1, EGF, エストロゲン）および細胞外マトリックスのリモデリングメカニズムのダウンレギュレーション。

意義および主張
著者らは、これらの知見は、mFPにおける「細胞分化、脂質代謝、ホルモン/栄養感知、およびストレス適応の協調的な抑制」を示していると主張している。本研究は、これら初期の脂肪組織発達における混乱が、mFPが代謝貯蔵庫およびシグナルハブとして機能する能力を損ない、将来の上皮膨張のためのエネルギーおよびパラクリンサポートを制限する可能性があると仮定している。

本論文は、子宮内の熱ストレスに曝露されたヘイファーにおいて、これまで報告されてきた乳腺発達および乳量の減少に対する直接的な関連性をさらに調査する必要はあるものの、観察された分子および組織学的変化は、以前に報告された現象に対するトランスクリプトーム的な背景を提供するものであると結論付けている。著者らは、これらの結果がmFPを環境プログラミングの敏感な標的として浮き彫りにしていることを強調しており、乳量ポテンシャルへの熱ストレスの負の影響は、間質環境の初期発達における摂動に根ざしていることを示唆している。本研究は、子宮内の熱ストレスによって阻害される上皮・間質間のクロス・トークの具体的なメカニズムを解明するために、共培養システムや空間的トランスクリプトミクスを統合した今後の研究を求めている。