Sequentially Self-Assembled Supramolecular Nanocomplexes Enable Systemic Cas9 RNP Delivery and In Vivo Tumor Genome Editing

Resumen Técnico: Nanocomplejos Supramoleculares Ensamblados Secuencialmente para la Entrega Sistémica de RNP de Cas9 y Edición Genómica de Tumores In Vivo

Planteamiento del Problema
La traslación clínica de las terapias de ribonucleoproteína (RNP) CRISPR–Cas9 para la edición genómica in vivo se ve actualmente obstaculizada por dos barreras intrínsecas: la rápida depuración de la sangre y la falta de sistemas de entrega capaces de realizar un direccionamiento tumoral sistémico. Las RNP libres (~12 nm, ligeramente aniónicas) sufren una pobre translocación a través de la membrana celular, limitaciones en la importación nuclear y una rápida degradación enzimática por parte de las RNasas y proteasas en la circulación. Si bien los portadores existentes (por ejemplo, nanopartículas lipídicas catiónicas, nanopartículas de oro) mejoran la entrega citosólica, a menudo carecen de un control preciso sobre la liberación intracelular y de una retención sanguínea suficiente para el direccionamiento sistémico. En consecuencia, la mayoría de los estudios in vivo dependen de la inyección local o de la acumulación hepática, y la correlación cuantitativa entre la farmacocinética y la eficiencia de edición in situ sigue siendo una necesidad no satisfecha.

Metodología
Los autores desarrollaron una plataforma de complejos ternarios supramoleculares utilizando el autoensamblaje secuencial para encapsular RNP de Cas9/sgRNA. El sistema consta de tres componentes:

1. Carga: Complejos RNP de Cas9/sgRNA.
2. Estabilizador del Núcleo: Ácido tánico (TA), un polifenol biodegradable que interactúa con las proteínas mediante enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas.
3. Estabilizador de la Cáscara: Polímeros de bloque conjugados con ácido fenilborónico (PBA). Se sintetizaron y probaron dos polímeros específicos: P[Glu(DET)/Glu(FPBA)] (que contiene restos de etilendiamina) y P[Lys/Lys(FPBA)] (que contiene restos de amina primaria).

Proceso de Ensamblaje:
Las RNP se mezclaron primero con TA para formar complejos RNP/TA. Posteriormente, estos se mezclaron con polímeros conjugados con PBA. Al pH fisiológico (7.4), los grupos galoilo del TA forman ésteres de boronato reversibles con las cadenas laterales de PBA, creando un nanocomplejo ternario núcleo-cáscara de ~30 nm. El sistema está diseñado para ser sensible al pH: los ésteres de boronato se disocian bajo la acidez endosómica (pH 5.5), lo que desencadena la liberación de la carga de RNP.

Contribuciones Clave y Resultados

• Caracterización y Estabilidad:

  • Los complejos ternarios (específicamente el complejo RNP/TA/polímero-PBA) exhibieron un diámetro hidrodinámico de aproximadamente 21–28 nm, significativamente menor que los complejos microagregados de RNP/TA (~49 nm).
  • Estabilidad Sérica: En presencia de suero fetal bovino (FBS), los complejos ternarios mantuvieron tamaños de partícula estables, mientras que los complejos RNP/TA se desestabilizaron. La cáscara de PEG de los polímeros evitó la formación de la corona de proteínas y protegió el núcleo de RNP.
  • Protección Enzimática: Los complejos ternarios protegieron con éxito el sgRNA de la degradación por RNasa y componentes séricos, mientras que las RNP libres y los complejos RNP/TA mostraron una degradación significativa.
  • Sensibilidad al pH: Los complejos se mantuvieron estables a pH 7.4, pero se disociaron y liberaron la carga de RNP a pH 5.5, imitando las condiciones endosómicas.

• Captación Celular y Distribución Subcelular:

  • La citometría de flujo y la microscopía de barrido confocal (CLSM) demostraron que los complejos ternarios recubiertos con polímeros facilitaron la internalización mediada por endocitosis.
  • A diferencia de las RNP libres, que permanecieron mayoritariamente en la membrana celular, los complejos ternarios escaparon de los endosomas y se translocaron al núcleo.
  • El análisis FCS indicó que la RNP se disocia del portador polimérico dentro de la célula, permitiendo que la Rña funcione de forma independiente.

• Knockout Genético In Vitro:

  • En células HeLa-Luc, las RNP libres y los complejos RNP/TA mostraron un knockout génico insignificante (reducción de la luminiscencia similar a los controles).
  • Los complejos ternarios lograron un knockout génico significativo: la RNP/TA/P[Glu(DET)/Glu(FPBA)] redujo la actividad de la luciferasa en un ~13%, mientras que la RNP/TA/P[Lys/Lys(FPBA)] la redujo en un ~40%.
  • Los ensayos de endonucleasa T7 (T7EI) confirmaron la escisión del ADN, y los ensayos de escisión in vitro demostraron que los complejos retuvieron la actividad de edición específicamente a pH ácido (5.5), confirmando la liberación estimulada por el estímulo.

• Biodistribución y Farmacocinética In Vivo:

  • Tras la administración intravenosa en ratones con tumores, los complejos ternarios exhibieron una circulación sanguínea prolongada en comparación con las RNP libres o los complejos RNP/TA.
  • Acumulación Tumoral: Ambos complejos ternarios lograron una acumulación tumoral de 2–4% ID/g, significativamente mayor que el ~1% ID/g observado para las RNP libres. Esto se atribuye al efecto de Aumento de la Permeabilidad y Retención (EPR).
  • Distribución en Órganos: Las dos variantes de polímeros mostraron perfiles de biodistribución distintos. El P[Glu(DET)/Glu(FPBA)] se acumuló más en los riñones, mientras que el P[Lys/Lys(FPBA)] se acumuló más en el hígado, probablemente debido a diferencias en la estabilidad estructural y la densidad de carga superficial.

• Edición Genética In Vivo y Eficacia Antitumoral:

  • Knockout de Luciferasa: En modelos de tumor HeLa-Luc, los complejos ternarios lograron una eficiencia de edición génica (frecuencia de indel) del 37.2% en el sitio del tumor, en comparación con solo el 1.5% de las RNP libres. Esto resultó en una supresión significativa de la luminiscencia tumoral.
  • Knockout de Oncogenes: La plataforma se utilizó para atacar oncogenes "no tratables".
    • PLK1: El knockout de la proteína quinasa tipo Polo 1 (PLK1) en tumores HeLa-Luc suprimió significativamente el crecimiento tumoral.
    • KRAS: En modelos tumorales HCT116 (que portan la mutación KRAS G13D), el knockout del gen KRAS mutante mediante los complejos ternarios impidió significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los controles.
  • Seguridad: El tratamiento mostró una toxicidad insignificante, sin cambios significativos en el peso corporal o en los parámetros sanguíneos (marcadores de función hepática/renal) en comparación con los controles.

Significado y Reivindicaciones
Los autores afirman haber establecido, por primera vez, una relación cuantitativa farmacocinética–edición para un portador de RNP en un modelo de tumor sólido. El estudio demuestra que un complejo ternario supramolecular, formado mediante el autoensamblaje secuencial de TA y polímeros conjugados con PBA, puede superar las barreras de la entrega sistémica de RNP.

La importancia de este trabajo radica en:

1. Entrega Sistémica: Permite la administración sistémica de RNP de Cas9, yendo más allá de la inyección local o el direccionamiento específico al hígado.
2. Liberación Sensible a Estímulos: La plataforma utiliza el pH endosómico para activar la liberación de la carga, asegurando que la RNP esté activa solo tras la internalización celular.
3. Potencial Terapéutico: El sistema logra el knockout de oncogenes difíciles de atacar (KRAS mutante, PLK1) y suprime el crecimiento tumoral in vivo sin toxicidad sistémica.
4. Marco Generalizable: Los autores postulan que esta estrategia proporciona un marco generalizable para el desarrollo de terapias CRISPR administradas sistémicamente in vivo, abordando las limitaciones de direccionamiento tisular de los sistemas de entrega convencionales.

El artículo concluye que, si bien no se observó una remisión completa en los estudios antitumorales, el retraso significativo en el crecimiento tumoral y la alta eficiencia de edición (37.2%) validan la plataforma como una estrategia prometedora para la terapia génica contra el cáncer. Se sugiere que la optimización futura debe centrarse en mejorar la acumulación y retención tumoral, potencialmente mediante la adición de ligandos de direccionamiento tumoral.