Genome-wide identification and integrative analysis of the WRKY gene family reveal candidate regulators involved in biotic stress responses in Hass avocado

Resumen Técnico: Identificación a escala genómica y análisis integrativo de la familia de genes WRKY en el aguacate Hass

Planteamiento del problema
El aguacate (Persea americana Mill.), específicamente el cultivar Hass, es un importante cultivo de frutas tropicales y subtropicales que enfrenta pérdidas económicas significativas debido a estreses bióticos, incluyendo la herbivoría por insectos (p. ej., la infestación de la mosca de la hoja) y las infecciones por patógenos (p. ej., Pseudocercospora purpurea que causa la mancha de la hoja). Aunque se sabe que los factores de transcripción WRKY son fundamentales en la regulación de los mecanismos de defensa vegetal, la señalización hormonal y las respuestas al estrés, la caracterización exhaustiva a escala genómica de la familia de genes WRKY en el aguacate Hass sigue estando mayormente desinvestigada. Los estudios previos sobre los genes WRKY en aguacates se limitaron a accesiones de la variedad West Indian y no abordaron plenamente el trasfondo genético específico y los mecanismos de respuesta al estrés de la variedad Hass, que es la dominante comercialmente.

Metodología
El estudio empleó un enfoque multi-ómico para caracterizar sistemáticamente la familia de genes WRKY en el aguacate Hass:

• Identificación a escala genómica: Utilizando búsquedas BLASTP y HMMER contra el ensamblaje más reciente del genoma del aguacate Hass (GCA_051132755.1), se identificaron 70 genes PaWRKY y se validaron sus dominios conservados.
• Análisis evolutivo y estructural: Los investigadores realizaron un análisis filogenético (Neighbor-Joining), mapeo cromosómico y análisis de sintenia con Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Cinnamomum camphora y Ananas comosus. Los eventos de duplicación génica (tándem y segmentaria) se analizaron mediante MCScanX, y la presión de selección se evaluó mediante las proporciones Ka/Ks. Los motivos conservados, las estructuras génicas y los elementos de respuesta a cis en las regiones promotoras se analizaron utilizando las bases de datos MEME, PlantCARE y CDD.
• Perfil de transcriptoma: Se realizó RNA-seq en cuatro tipos de tejidos bajo tres condiciones: hojas sanas (CKL), hojas infestadas por insectos (IHL), hojas enfermas (DL), frutos sanos (CKF) y frutos perforados por insectos (IHF).
• Análisis de datos integrativo: Para identificar reguladores clave, el estudio integró el agrupamiento K-means, el Análisis de Red de Coexpresión de Genes Ponderados (WGCNA) y el cribado de Genes Diferencialmente Expresados (DEG) (usando DESeq2). Se utilizó un gráfico UpSet para intersectar estos conjuntos de datos con el fin de localizar genes candidatos centrales de alta confianza.
• Validación y modelado: Los genes candidatos seleccionados se validaron mediante qRT-PCR. Además, se predijeron las estructuras proteicas 3D de los candidatos principales de respuesta al estrés utilizando SWISS-MODEL.

Resultados clave

• Caracterización de la familia de genes: Se identificaron un total de 70 genes PaWRKY, distribuidos de manera desigual en 12 cromosomas, con la mayor densidad en el Cromosoma 1. El análisis filogenético los clasificó en tres grupos (I, II, III), siendo el Grupo II el más grande, con 48 miembros, y subdividiéndose este último en cinco subgrupos (IIa–IIe).
• Mecanismos evolutivos: Se identificó la duplicación segmentaria como el principal motor de la expansión de la familia PaWRKY, con 32 pares duplicados segmentariamente y 5 pares tándem. La mayoría de los pares duplicados exhibieron proporciones Ka/Ks < 0.4, lo que indica una fuerte selección purificadora.
• Diversidad estructural: Aunque el dominio WRKY conservado y los motivos de dedos de zinc se preservaron en gran medida, se observaron variaciones en subgrupos específicos (p. ej., variantes WRKYGKK y WKKYGQK en el heptapéptido). El análisis de los promotores reveló una rica gama de elementos de respuesta a cis sensibles a la luz, hormonas (SA, JA, ABA, GA) y estreses abióticos/bióticos.
• Expresión específica de tejido y respuesta al estrés:
  • Los genes PaWRKY mostraron patrones distintos de especificidad tisular, con la mayoría altamente expresados en las hojas.
  • Estrés por enfermedad vs. insecto: La infección por patógenos (DL) desencadenó una respuesta de defensa más extensa y robusta en comparación con la herbivoría por insectos (IHL). Las hojas enfermas mostraron la regulación al alza de genes vinculados a la senescencia, abscisión y señalización de MAPK, mientras que las hojas infestadas por insectos indujeron principalmente genes relacionados con la fotosíntesis y vías de defensa específicas.
  • Respuesta del fruto: Los frutos perforados por insectos (IHF) mostraron la regulación al alza de la mayoría de los genes PaWRKY, aunque menos candidatos centrales cumplieron con los estrictos criterios de intersección en comparación con los estreses de las hojas.
• Identificación de genes candidatos centrales: A través del análisis integrativo (UpSet), se identificaron 16 genes PaWRKY centrales como reguladores clave en hojas enfermas, 4 en hojas infestadas por insectos y solo 1 en frutos perforados por insectos. Los candidatos notables incluyeron PaWRKY4, PaWRKY5, PaWRKY9 (enfermedad) y PaWRKY14, PaWRKY40 (alimentación de insectos).
• Estructura de la proteína: El modelado 3D de los candidatos centrales reveló variaciones estructurales localizadas en las regiones periféricas de la hélice α, manteniendo los dominios WRKY altamente conservados, lo que sugiere una base para la diversificación funcional.

Significancia y afirmaciones
Los autores afirman que este estudio proporciona la primera caracterización sistemática de la familia de genes WRKY específicamente en el cultivar de aguacate Hass. La investigación elucida la historia evolutiva de la familia, destacando la duplicación segmentaria y la selección purificadora como fuerzas evolutivas clave. Al integrar datos transcriptómicos de diversos escenarios de estrés biótico, el estudio identifica genes PaWRKY candidatos específicos que responden diferencialmente a patógenos fúngicos frente a herbívoros por insectos.

El artículo sostiene que estos hallazgos ofrecen un recurso valioso para el futuro mejoramiento de la resistencia y el fortalecimiento molecular del aguacate. Específicamente, los genes centrales identificados (p. ej., aquellos involucrados en la regulación de la senescencia durante la enfermedad o vías de defensa específicas contra insectos) sirven como posibles objetivos para comprender los mecanismos moleculares de la resistencia al estrés biótico. El estudio enfatiza que la infección por patógenos en las hojas de aguacate provoca una reprogramación transcripcional más amplia e intensa, incluyendo vías de daño tisular y senescencia, en comparación con la alimentación de insectos, una distinción crítica para el desarrollo de estrategias de manejo dirigido.