Induced alanine auxotrophy as a therapeutic strategy against Mycobacterium tuberculosis

Résumé technique : L'induction de l'auxotrophie de l'alanine comme stratégie thérapeutique contre Mycobacterium tuberculosis

Énoncé du problème
Le fardeau mondial de la tuberculose (TB), particulièrement des souches multirésistantes (MDR-TB) et extrêmement résistantes (XDR-TB), demeure une crise de santé publique critique. Les schémas thérapeutiques actuels sont longs, complexes et sujets à l'échec en raison de la non-observance et de l'émergence de la résistance. Il existe un besoin urgent de nouveaux agents antituberculeux agissant par des mécanismes jusqu'alors inexploités. Alors que les cibles traditionnelles impliquent la réplication de l'ADN, la synthèse protéique et la biosynthèse de la paroi cellulaire, les voies métaboliques essentielles, spécifiquement la biosynthèse des acides aminés, ont reçu comparativement moins d'attention. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) possède des voies de biosynthèse robustes pour la plupart des acides aminés, ce qui lui permet de survivre dans l'environnement pauvre en nutriments des macrophages de l'hôte. Perturber ces voies représente une stratégie potentielle pour induire l'auxotrophie et atténuer la virulence. Cependant, l'essentialité de certaines enzymes spécifiques comme l'alanine aminotransférase (AlaA, codée par Rv0337c) lors de l'infection est restée incertaine en raison de données conflictuelles issues de criblages de transposons in vivo et d'une potentielle redondance fonctionnelle.

Méthodologie
L'étude a employé une approche multidimensionnelle combinant la chimiogénomique computationnelle, la biologie des systèmes, la caractérisation biochimique et la validation in vivo :

1. Repositionnement de médicaments : L'équipe a utilisé la plateforme de découverte chimiogénomique Trudeau pour identifier le TI-374 (PF-04859989), un composé d'acide hydroxamique initialement développé comme inhibiteur de la kynurénine aminotransférase II (KAT II) humaine, comme un inhibiteur potentiellement réactif de manière croisée des transférases dépendantes du PLP de Mtb.
2. Analyse des systèmes : Des profils transcriptomiques (RNA-seq) et métabolomiques non ciblés (LC-MS) de Mtb traités par le TI-374 ont été réalisés pour identifier les voies et les signatures métaboliques perturbées.
3. Validation génétique et phénotypique :
   • Des essais de supplémentation en acides aminés ont été effectués pour déterminer si des auxotrophies spécifiques pouvaient restaurer l'activité du médicament.
   • Un mutant ΔalaA a été généré et complémenté pour évaluer l'exigence génétique d'AlaA.
   • La cartographie de la résistance via le séquençage du génome entier de mutants résistants au TI-374 a été utilisée pour identifier la cible primaire.
4. Caractérisation biochimique : Les enzymes recombinantes AlaA et HisC1 ont été purifiées et soumises à des essais enzymatiques pour déterminer la cinétique d'inhibition (IC50, kinact, Ki), la réversibilité (essais de dilution par saut et de dialyse) et le mécanisme d'action.
5. Modélisation structurale : Un modèle d'homologie de l'AlaA de Mtb a été généré sur la base de l'AlaA d'E. coli pour prédire les modes de liaison et rationaliser les mutations de résistance.
6. Optimisation chimique : Des études de relation structure-activité (SAR) ont été menées pour optimiser le TI-374 en un analogue plus puissant, le TI-801.
7. Modèles in vivo et intracellulaires : L'efficacité des composés et l'exigence génétique d'AlaA ont été évaluées dans des modèles d'infection de macrophages THP-1 et un modèle de souris infectées par aérosol aigu.

Contributions clés et résultats

• Identification de la cible : Il a été constaté que le TI-374 inhibe Mtb avec une puissance sub-micromolaire (CMI = 0,54 µM contre H37Rv). L'analyse des systèmes a révélé une signature de carence en acides aminés, spécifiquement une déplétion en alanine. La supplémentation en alanine, mais pas en histidine ou autres acides aminés, a complètement abrogé l'activité du TI-374, portant la CMI à >5 µM.
• Mécanisme d'action : Les essais biochimiques ont confirmé que le TI-374 inhibe deux aminotransférases dépendantes du PLP : AlaA (IC50 = 23 nM) et HisC1 (IC50 = 619 nM). Crucialement, le TI-374 agit comme un inhibiteur irréversible et de type mécanisme de l'AlaA, formant un adduit covalent avec le cofacteur PLP. En revanche, l'inhibition de HisC1 est partiellement réversible.
• Cartographie de la résistance : La sélection de mutants résistants a identifié une mutation ponctuelle unique (Ala270Thr) dans le gène alaA (Rv0337c), confirmant l'AlaA comme la cible intracellulaire primaire. La modélisation structurale suggère que cette mutation perturbe la géométrie de la poche de liaison.
• Optimisation chimique : L'optimisation de l'échafaudage du TI-374 a produit le TI-801, présentant un substituant 6-chloro. Le TI-801 a démontré une puissance améliorée avec une CMI de l'ordre du nanomolaire bas (93 nM) et une IC50 pour l'AlaA de 10,1 nM. Comme le TI-374, le TI-801 inhibe l'AlaA de manière irréversible mais reste partiellement réversible contre HisC1.
• Efficacité dans un contexte d'hôte :
  • Intracellulaire : Dans les macrophages THP-1, le TI-374 et le TI-801 ont conservé leur activité contre Mtb intracellulaire. Notamment, la supplémentation exogène en alanine n'a pas permis de restaurer la croissance intracellulaire, suggérant que l'alanine dérivée de l'hôte est insuffisante pour contourner l'inhibition de l'AlaA au sein du phagosome.
  • Délétion génétique : Le mutant ΔalaA a présenté un défaut de croissance sévère en bouillon (restauré par l'alanine) mais a été significativement atténué dans les poumons de souris (15 jours après l'infection), ne récupérant qu'une seule colonie dans certains de ces souris. La complémentation a restauré la virulence.
  • Pharmacologique vs Génétique : L'inhibition pharmacologique de l'AlaA a mimé la délétion génétique dans le modèle de souris, confirmant que l'AlaA est une vulnérabilité pertinente pour l'hôte.

Signification et revendications
L'article établit l'AlaA comme une nouvelle vulnérabilité métabolique pertinente pour l'hôte de Mtb. Les auteurs affirment que :

1. L'AlaA est essentielle in vivo : Bien que Mtb puisse puiser l'alanine dans le bouillon, l'enzyme est critique pour la survie dans l'environnement limité en nutriments de l'hôte (macrophages et poumons de souris), où l'alanine exogène ne peut compenser sa perte.
2. L'inhibition irréversible est la clé : L'activité antituberculeuse est principalement pilotée par l'inhibition irréversible de l'AlaA. La réversibilité partielle de l'inhibition de HisC1 suggère que, bien que HisC1 soit une cible secondaire, l'AlaA est l'étape engagée pour l'activité antimicrobienne de l'échafaudage.
3. Validation du ciblage métabolique : L'étude démontre que les cibles métaboliques, qui peuvent paraître contournables in vitro via la supplémentation en nutriments, peuvent être essentielles in vivo en raison des limitations d'accès aux nutriments au sein des tissus de l'hôte.
4. Le TI-801 comme sonde : Le TI-801 sert de sonde chimique puissante, de l'ordre du nanomolaire bas, pour valider l'AlaA comme cible antituberculeuse.

Les auteurs concluent que, bien que l'échafaudage du TI-374 nécessite une optimisation supplémentaire (spécifiquement concernant la stabilité métabolique et la glucuronidation) pour devenir un candidat médicament viable, la stratégie consistant à induire l'auxotrophie de l'alanine via l'inhibition irréversible de l'AlaA représente une voie prometteuse pour le développement de thérapies de nouvelle génération, fondées sur le mécanisme, contre la tuberculose résistante. Les conclusions sont renforcées par une corroboration indépendante d'une étude distincte (Edoo et al.) identifiant les mêmes cibles (AlaA et HisC1) en utilisant un échafaudage chimique apparenté.