Isolation of oxygen-dependent nicotine- and pseudooxynicotine-metabolizing enzymes
यह अध्ययन *Peribacillus frigoricolerans* NIC8 से दो नवीन ऑक्सीजन-निर्भर फ्लेविन एमीन ऑक्सीडोरडस, Ncox और Pnox की पहचान और लक्षण वर्णन करता है जो निकोटीन और स्यूडोऑक्सीनिकोटिन को कुशलतापूर्वक मेटाबोलाइज करते हैं, जो बेहतर धूम्रपान-निकासी चिकित्सा और निकोटीन बायोकन्वर्जन के लिए आशाजनक उम्मीदवार पेश करते हैं।
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द दशकों से, वैज्ञानिक निकोटीन की लत के प्रभाव को तोड़ने के लिए एक जैविक तरीके की तलाश कर रहे हैं। विचार सरल है: यदि आप शरीर में एक ऐसा एंजाइम पेश कर सकें जो मस्तिष्क तक पहुँचने से पहले ही निकोटीन को तेजी से नष्ट कर दे, तो धूम्रपान करने की इच्छा समाप्त हो सकती है। प्रकृति ने इस काम के लिए पहले से ही एक उम्मीदवार प्रदान किया है। मिट्टी में पाए जाने वाले एक बैक्टीरिया, Pseudomonas putida, में एक एंजाइम होता है जिसे NicA2 कहा जाता है जो निकोटीन को एक हानिरहित पदार्थ में बदल सकता है। हालांकि, इस प्राकृतिक संस्करण में एक बड़ी खामी है। बैक्टीरिया के भीतर, यह एंजाइम एक विशेष मशीन की तरह काम करता है जिसे कार्य करने के लिए एक विशिष्ट साथी, एक छोटा प्रोटीन, जिसे साइटोक्रोम कहा जाता है, की आवश्यकता होती है। उस साथी के बिना, यह एंजाइम अविश्वसनीय रूप से धीमा है, ऑक्सीजन के साथ इतनी सुस्ती से प्रतिक्रिया करता है कि मानव रोगी में इसे काम करने के लिए भारी, अव्यवहारिक खुराक की आवश्यकता होगी। शोधकर्ताओं ने लैब में एंजाइम की संरचना में बदलाव करके इसे ठीक करने की कोशिश की, जिससे यह तेज़ हो सके, लेकिन वे एक दीवार से टकरा गए। वह एंजाइम ऑक्सीजन का उपयोग करने में खुद को बहुत तेज़ बनाने में विफल रहा।
एक बेहतर समाधान खोजने के लिए, शोधकर्ताओं के एक दल ने पुराने मशीन को ठीक करने की कोशिश करने के बजाय पूरी तरह से एक नई मशीन की तलाश करने का निर्णय लिया। वे मिट्टी और तंबाकू के कचरे में उन बैक्टीरिया की खोज में निकले जो निकोताल को अपने एकमात्र भोजन के रूप में खा सकें, इस उम्मीद में कि उन्हें एक ऐसा स्वाभाविक रूप से विकसित एंजाइम मिल जाए जो ऑक्सीजन के साथ कुशलता से काम करता हो। उन्हें वही मिला जो वे खोज रहे थे, Peribacillus frigoritolerans नामक बैक्टीरिया के एक स्ट्रेन में। यह सूक्ष्मजीव, जिसे एक बिना सिगरेट पी हुई सिगरेट से अलग किया गया था, एंजाइमों का एक अनूठा सेट रखता है जो वास्तविक ऑक्सीडाइज़र (oxidizers) के रूप में कार्य करते हैं। धीमे, साथी-निर्भर NicA2 के विपरीत, ये नए एंजाइम, जिन्हें Ncox और Pnox नाम दिया गया है, निकोटीन और उसके रासायनिक संबंधी, स्यूडोऑक्सीनिकोटिन (pseudooxynicotine), को पकड़ सकते हैं और केवल हवा में मौजूद ऑक्सीजन का उपयोग करके उन्हें तेजी से तोड़ सकते हैं। जिस गति से वे काम करते हैं, वह मूल NicA2 की तुलना में लगभग एक हजार गुना तेज़ है जब ईंधन के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग किया जाता है, जो लत के उपचार के लिए एक आशाजनक नया मार्ग प्रदान करता है।
यह यात्रा एक सरल अवलोकन के साथ शुरू हुई। शोधकर्ताओं ने तंबाकू के खेतों और सिगरेट के टुकड़ों से नमूने लिए, और उन्हें प्लेटों पर रखा जहाँ निकोटीन एकमात्र उपलब्ध भोजन था। अधिकांश बैक्टीरिया भूखे मर गए, लेकिन एक कॉलोनी मजबूती से विकसित हुई। आनुवंशिक विश्लेषण ने इस उत्तरजीवी की पहचान Peribacillus frigoritolerans के एक स्ट्रेन के रूप में की, जो एक ऐसी प्रजाति है जो पहले से मौजूद ज्ञात थी लेकिन निकोटीन खाने के लिए नहीं जानी जाती थी। जब शोधकर्ताओं ने बैक्टीरिया से एक विशिष्ट 123,000-बेस-पेयर रिंग, जिसे प्लास्मिड (plasmid) कहा जाता है, को हटा दिया, तो जीव ने तुरंत निकोटीन पर बढ़ने की अपनी क्षमता खो दी। इसने सिद्ध कर दिया कि उसके आहार का रहस्य इस अतिरिक्त आनुवंशिक सामग्री पर कोडित था। उस प्लास्मिड के भीतर, टीम को दो जीन मिले जो एक-दूसरे के ठीक बगल में स्थित थे, जिन्हें उन्होंने ncox और pnox नाम दिया। ये जीन उन एंजाइमों का उत्पादन करते थे जो प्रसिद्ध NicA2 के समान दिखते थे लेकिन इतने भिन्न थे कि यह संकेत मिलता था कि वे अलग से विकसित हुए हैं।
यह समझने के लिए कि ये एंजाइम कैसे काम करते हैं, टीम ने E. coli बैक्टीरिया का उपयोग करके लैब में इनका उत्पादन किया और उन्हें क्रिया में देखा। उन्होंने देखा कि जब Ncox एंजाइम निकोटीन से मिला, तो वह लगभग तुरंत पीले से पारदर्शी हो गया, जो एक दृश्य संकेत था कि वह निकोटीन को रासायनिक रूप से बदल रहा है। Pnox एंजाइम ने भी वही किया जब वह स्यूडोऑक्सीनिकोटिन से मिला, जो एक ऐसा पदार्थ है जो हवा में निकोटीन के टूटने के पहले उत्पाद के बैठने से स्वाभाविक रूप से बनता है। महत्वपूर्ण रूप से, इनमें से किसी भी एंजाइम को यह करने के लिए साथी प्रोटीन की आवश्यकता नहीं थी; वे सीधे हवा में मौजूद ऑक्सीजन के साथ काम करते थे। जब शोधकर्ताओं ने इस प्रतिक्रिया की गति को मापा, तो उन्होंने पाया कि Ncox प्रति सेकंड 7.7 बार निकोटीन को संसाधित कर सकता है, जबकि Pnox अपने लक्ष्य को 3.9 बार प्रति सेकंड संसाधित करता है। ये संख्याएँ मूल NicA2 की तुलना में बहुत बेहतर हैं, जो ऑक्सीजन के साथ अकेले काम करने पर प्रति सेकंड केवल लगभग 0.007 प्रतिक्रियाएं प्रबंधित करती है।
शोधकर्ताओं ने यह भी देखा कि ये एंजाइम ऑक्सीजन अणु को कैसे संभालते हैं। 'ट्रांजिएंट काइनेटिक्स' (transient kinetics) नामक एक प्रक्रिया में, उन्होंने एक रैपिड-फ्लो मशीन में एंजाइमों को ऑक्सीजन के साथ मिलाया ताकि प्रतिक्रिया की सटीक गति को मापा जा सके। उन्होंने पाया कि Ncox और Pnox प्रति यूनिट सांद्रता के अनुसार क्रमशः 51,100 और 81,000 प्रति सेकंड की दर से ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। ये दरें प्रकृति में अन्य अत्यधिक कुशल एंजाइमों के तुलनीय हैं जो वास्तविक ऑक्सीडाइज़र के रूप में जाने जाते हैं, और वे NicA2 की तुलना में हजारों गुना तेज़ हैं। इससे पुष्टि हुई कि नए एंजाइम केवल पुराने के थोड़े बेहतर संस्करण नहीं हैं, बल्कि मौलिक रूप से अलग मशीनें हैं जिन्हें ऑक्सीजन से भरपूर वातावरण में बिना किसी साइटोक्रोम साथी के काम करने के लिए विकसित किया गया है।
यह साबित करने के लिए कि क्या ये एंजाइम वास्तव में एक जैविक प्रणाली में लापता साथी की जगह ले सकते हैं, टीम ने एक 'रेस्क्यू एक्सपेरिमेंट' (rescue experiment) किया। उन्होंने मूल Pseudomonas putida बैक्टीरिया का एक स्ट्रेन लिया जिसे इसके साइटोक्रोम साथी के बिना आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया था, जिससे वह निकोटीन खाने में असमर्थ हो गया था। जब उन्होंने इस अक्षम बैक्टीरिया को नए Ncox एंजाइम का जीन दिया, तो बैक्टीरिया ने तुरंत निकोटीन पर बढ़ने की क्षमता फिर से प्राप्त कर ली। वास्तव में, बैक्टीरिया पुराने NicA2 के सबसे अच्छे प्रयोगशाला-विकसित संस्करण की तुलना में अधिक तेज़ी से विकसित हुआ। इसने प्रदर्शित किया कि नया एंजाइम एक जीवित प्रणाली में स्वतंत्र रूप से और कुशलता से कार्य कर सकता है, और उस जटिल कोशिकीय मशीनरी की आवश्यकता को दरकिनार कर सकता है जिसकी मूल एंजाइम को आवश्यकता थी।
अध्ययन ने यह भी खुलासा किया कि ये बैक्टीरिया इन एंजाइमों को कैसे नियंत्रित करते हैं। निकोटीन पर बढ़ने बनाम किसी अन्य खाद्य स्रोत पर बढ़ने के दौरान बैक्टीरिया की आनुवंशिक गतिविधि की तुलना करके, शोधकर्ताओं ने देखा कि जब निकोटीन मौजूद होता है तो Ncox और Pnox के जीन उच्च स्तर पर सक्रिय होते हैं। यह सुझाव देता है कि बैक्टीरिया स्वाभाविक रूप से इन एंजाइमों का उपयोग निकोटीन को पचाने के लिए करता है जब वह अपने पर्यावरण में मिलता है। आनुवंशिक विश्लेषण ने आगे दिखाया कि ये एंजाइम संभवतः अन्य बैक्टीरिया में पाए जाने वाले एक सामान्य पूर्वज से विकसित हुए हैं, लेकिन उन्होंने NicA2 से अलग पथ अपनाया जो मिट्टी के बैक्टीरिया में पाया जाता है। जबकि NicA2 साइटोक्रोम प्रणाली से बंधा रहा, इन नए Peribacillus एंजाइमों ने सीधे ऑक्सीजन का उपयोग करने के लिए विकास किया, शायद इसलिए क्योंकि उनके विशिष्ट वातावरण ने इस सरल, तेज़ विधि को प्राथमिकता दी।
इस खोज के निहितार्थ भविष्य के लत उपचार के लिए महत्वपूर्ण हैं। लत के उपचार के लिए एंजाइमों का उपयोग करने का प्राथमिक लक्ष्य दवा को रक्तप्रवाह से इतनी जल्दी साफ करना है कि मस्तिष्क को 'हाई' महसूस करने से रोका जा सके। मूल NicA2 एंजाइम इसे करने के लिए बहुत धीमा था, क्योंकि इसके लिए भारी मात्रा में खुराक की आवश्यकता होती जो उत्पादन में कठिन और महंगी होती। नया Ncox एंजाइम, ऑक्सीजन के साथ तेजी से काम करने की अपनी क्षमता के साथ, एक बहुत अधिक व्यावहारिक समाधान प्रदान करता है। यह एक स्वाभाविक रूप से मौजूद, अत्यधिक कुशल उपकरण है जिसे उन जटिल कोशिकीय साथियों की आवश्यकता नहीं है जो इसके पूर्ववर्तियों के प्रदर्शन को सीमित करते हैं। हालांकि शोधकर्ता नोट करते हैं कि मानव उपयोग के लिए इसे अनुकूलित करने हेतु अभी और परीक्षण की आवश्यकता है, यह खोज एक शक्तिशाली नया उम्मीदवार प्रदान करती है जिसे प्रकृति ने पहले से ही आवश्यक चिकित्सीय प्रभाव के लिए आवश्यक गति के साथ परिष्कृत किया है।
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