Isolation of oxygen-dependent nicotine- and pseudooxynicotine-metabolizing enzymes

Al decennia lang zoeken wetenschappers naar een biologische manier om de greep van nicotineverslaving te verbreken. Het idee is simpel: als je een enzym in het lichaam zou kunnen introduceren dat nicotine razendsnel vernietigt voordat het de hersenen bereikt, zou de drang om te roken kunnen verdwijnen. De natuur heeft al een kandidaat voor deze taak geleverd. Een bacterie die in de bodem wordt gevonden, Pseudomonas putida, produceert een enzym genaamd NicA2 dat nicotine kan omzetten in een onschadelijke stof. Echter, deze natuurlijke versie heeft een groot gebrek. Binnen de bacterie werkt het enzym als een gespecialiseerde machine die een specifieke partner nodig heeft, een klein eiwit genaamd een cytochroom, om te functioneren. Zonder die partner is het enzym ongelooflijk traag; het reageert zo traag met zuurstof dat er enorme, onpraktische doses nodig zouden zijn om in een menselijke patiënt te werken. Onderzoekers hebben geprobeerd dit op te lossen door de structuur van het enzym in het laboratorium aan te passen om het sneller te maken, maar ze liepen tegen een muur aan. Het enzym weigert simpelweg veel sneller te worden in het gebruiken van zuurstof op eigen kracht.

Om een betere oplossing te vinden, besloot een team onderzoekers niet langer te proberen de oude machine te repareren, maar in plaats daarvan te zoeken naar een volledig nieuwe machine. Ze gingen op zoek in de bodem en het tabaksafval naar bacteriën die nicotine als hun enige voedselbron konden eten, in de hoop een natuurlijk geëvolueerd enzym te vinden dat efficiënt werkt met zuurstof. Ze vonden precies wat ze zochten in een bacteriestam genaamd Peribacillus frigoritolerans NIC8. Dit micro-organisme, geïsoleerd uit een ongeroken sigaret, bezit een unieke set enzymen die fungeren als echte oxidatoren. In tegenstelling tot de trage, partner-afhankelijke NicA2, kunnen deze nieuwe enzymen, genaamd Ncox en Pnox, nicotine en zijn chemische neefje, pseudooxynicotine, snel afbreken met behulp van alleen de zuurstof in de lucht. De snelheid waarmee ze werken is bijna duizend keer sneller dan de oorspronkelijke NicA2 wanneer zuurstof de brandstof is, wat een veelbelovend nieuw pad biedt voor de behandeling van verslaving.

De reis begon met een eenvoudige observatie. De onderzoekers namen monsters van tabaksvelden en sigarettenpeuken en plaatsten deze op petrischalen waar nicotine de enige beschikbare voedselbron was. De meeste bacteriën stierven, maar één kolonie groeide robuust. Genetische analyse identificeerde deze overlever als een stam van Peribacillus frigoritolerans, een soort die eerder bekend was, maar niet bekend stond om het eten van nicotine. Wanneer de onderzoekers een specifieke ring van 123.000 basenparen aan DNA, een plasmide genoemd, uit de bacterie verwijderden, verloor het organisme onmiddellijk het vermogen om op nicotine te groeien. Dit bewees dat het geheim van zijn dieet gecodeerd zat op dit extra stuk genetisch materiaal. Binnen dat plasmide vonden het team twee genen die direct naast elkaar lagen, die ze ncox en pnox noemden. Deze genen produceerden enzymen die leken op de beroemde NicA2, maar voldoende verschillend waren om te suggereren dat ze apart van elkaar geëvolueerd waren.

Om te begrijpen hoe deze enzymen werkten, produceerden het team de enzymen in het laboratorium met behulp van E. coli-bacteriën en observeerden ze in actie. Ze zagen dat wanneer het Ncox-enzym met nicotine in contact kwam, het bijna onmiddellijk van geel naar helder veranderde, een visueel teken dat het de nicotine chemisch aan het veranderen was. Het Pnox-enzym deed hetzelfde wanneer het met pseudooxynicotine werd geconfronteerd, een stof die van nature ontstaat wanneer het eerste product van de nicotineafbraak in de lucht ligt. Cruciaal was dat geen van beide enzymen een partner-eiwit nodig had om dit te doen; ze werkten direct met de zuurstof in de lucht. Wanneer de onderzoekers de snelheid van deze reactie maten, ontdekten ze dat Ncox nicotine kon verwerken met een snelheid van 7,7 keer per seconde, terwijl Pnox zijn doelwit verwerkte met 3,9 keer per seconde. Deze cijfers zijn vele malen superieur aan de oorspronkelijke NicA2, die slechts ongeveer 0,007 reacties per seconde realiseert wanneer het alleen met zuurstof wordt gelaten.

De onderzoekers keken ook naar hoe deze enzymen het zuurstofmolecuul zelf verwerken. In een proces genaamd transiënte kinetiek mengden ze de enzymen met zuurstof in een snelstromende machine om de exacte snelheid van de reactie te meten. Ze ontdekten dat Ncox en Pnox reageren met zuurstof op snelheden van respectievelijk 51.100 en 81.000 per seconde per eenheid concentratie. Deze snelheden zijn vergelijkbaar met andere zeer efficiënte enzymen in de natuur die bekend staan als echte oxidatoren, en ze zijn duizenden malen sneller dan NicA2. Dit bevestigde dat de nieuwe enzymen niet slechts licht verbeterde versies van de oude zijn, maar fundamenteel andere machines die door evolutie zijn ontworpen om in een zuurstofrijke omgeving te werken zonder een cytochroompartner nodig te hebben.

Om te bewijzen dat deze enzymen daadwerkelijk de ontbrekende partner in een biologisch systeem konden vervangen, voerde het team een reddingsexperiment uit. Ze namen een stam van de oorspronkelijke Pseudomonas putida bacterie die genetisch gemodificeerd was om zijn cytochroompartner te missen, waardoor de bacterie niet meer in staat was om nicotine te eten. Toen ze deze verzwakte bacterie het gen voor het nieuwe Ncox-enzym gaven, herwon de bacterie onmiddellijk het vermogen om op nicotine te groeien. Sterker nog, de bacterie groeide sneller met het nieuwe Ncox-enzym dan met de beste in het laboratorium geëvolueerde versie van de oude NicA2. Dit toonde aan dat het nieuwe enzym onafhankelijk en efficiënt kon functioneren in een levend systeem, waarbij het de complexe cellulaire machinerie die het oorspronkelijke enzym vereiste, omzeilde.

De studie onthulde ook hoe de bacteriën deze enzymen reguleren. Door de genetische activiteit van de bacterie te vergelijken wanneer deze op nicotine werd gekweekt versus wanneer deze op een andere voedingsbron werd gekweerd, zagen de onderzoekers dat de genen voor Ncox en Pnox hoog werden ingeschakeld wanneer nicotine aanwezig was. Dit suggereert dat de bacterie deze enzymen van nature gebruikt om nicotine te verteren wanneer het deze in zijn omgeving tegenkomt. De genetische analyse toonde verder aan dat deze enzymen waarschijnlijk geëvolueerd zijn uit een gemeenschappelijke voorouder in andere bacteriën, maar dat ze een ander evolutionair pad hebben genomen dan de NicA2 die in bodembacteriën voorkomt. Terwijl NicA2 verbonden bleef aan het cytochroomsysteem, zijn deze nieuwe enzymen in de Peribacillus geëvolueerd om zuurstof direct te gebruiken, mogelijk omdat de specifieke omgeving waarin zij leven de voorkeur gaf aan deze eenvoudigere, snellere methode.

De implicaties van deze ontdekking zijn aanzienlijk voor de toekomst van de behandeling van verslaving. Het primaire doel van het gebruik van enzymen bij de behandeling van nicotineverslaving is om de drug snel genoeg uit de bloedbaan te verwijderen om te voorkomen dat de hersenen de "high" voelen. Het oorspronkelijke NicA2-enzym was te traag om dit te doen zonder dat er enorme doses nodig waren die moeilijk en duur te produceren zouden zijn. Het nieuwe Ncox-enzym, met zijn vermogen om snel met zuurstof te werken, biedt een veel praktischerere oplossing. Het is een natuurlijk voorkomend, zeer efficiënt hulpmiddel dat niet de complexe cellulaire partners vereist die de prestaties van zijn voorgangers beperken. Hoewel de onderzoekers opmerken dat het enzym nog verdere tests nodig heeft om te zien of het geoptimaliseerd kan worden voor menselijk gebruik, biedt de ontdekking een krachtige nieuwe kandidaat die de natuur al heeft verfijnd om op de snelheid te werken die nodig is voor een therapeutisch effect.