Isolation of oxygen-dependent nicotine- and pseudooxynicotine-metabolizing enzymes

Per decenni, gli scienziati hanno cercato un modo biologico per spezzare la morsa della dipendenza da nicotina. L'idea è semplice: se si potesse introdurre nel corpo un enzima in grado di distruggere rapidamente la nicotina prima che raggiunga il cervello, l'impulso di fumare potrebbe svanire. La natura ha già fornito un candidato per questo compito. Un batterio trovato nel suolo, Pseudomonas putida, produce un enzima chiamato NicA2 che può convertire la nicotina in una sostanza innocua. Tuttavia, questa versione naturale presenta un grave difetto. All'interno del batterio, l'enzima funziona come una macchina specializzata che ha bisogno di un partner specifico, una piccola proteina chiamata citocromo, per funzionare. Senza quel partner, l'enzima è incredibilmente lento, reagendo con l'ossigeno in modo così pigro che richiederebbe dosi massicce e impraticabili per funzionare in un paziente umano. I ricercatori hanno cercato di risolvere il problema modificando la struttura dell'enzima in laboratorio, rendendolo più veloce, ma si sono scontrati con un muro. L'enzima semplicemente si rifiuta di diventare molto più veloce nell'utilizzare l'ossigeno da solo.

Per trovare una soluzione migliore, un team di ricercatori ha deciso di smettere di cercare di riparare la vecchia macchina e di cercarne invece una completamente nuova. Sono andati alla ricerca nel terreno e nei rifiuti di tabacco di batteri che potessero mangiare la nicotina come unica fonte di cibo, sperando di trovare un enzima evoluto naturalmente che funzioni efficientemente con l'ossigeno. Hanno trovato esattamente ciò che stavano cercando in un ceppo di batteri chiamato Peribacillus frigoritolerans NIC8. Questo microrganismo, isolato da una sigaretta non accesa, possiede un insieme unico di enzimi che agiscono come veri ossidanti. A differenza del lento e dipendente dal partner NicA2, questi nuovi enzimi, chiamati Ncox e Pnox, possono afferrare la nicotina e il suo cugino chimico, la pseudoossinicotina, e scomporli rapidamente utilizzando solo l'ossigeno presente nell'aria. La velocità con cui lavorano è quasi mille volte superiore rispetto all'originale NicA2 quando l'ossigeno è il combustibile, offrendo una nuova e promettente via per il trattamento della dipendenza.

Il viaggio è iniziato con una semplice osservazione. I ricercatori hanno prelevato campioni dai campi di tabacco e dai mozziconi di sigaretta, disponendoli su piastre dove la nicotina era l'unico alimento disponibile. La maggior parte dei batteri è morta di fame, ma una colonia è cresciuta vigorosamente. L'analisi genetica ha identificato questo sopravvissuto come un ceppo di Peribacillus frigoritolerans, una specie precedentemente nota per esistere ma non nota per mangiare nicotina. Quando i ricercatori hanno rimosso un anello specifico di DNA di 123.000 paia di basi, noto come plasmide, dall'organismo, questo ha immediatamente perso la capacità di crescere sulla nicotina. Ciò ha dimostrato che il segreto della sua dieta era codificato in questo pezzo extra di materiale genetico. All'interno di quel plasmide, il team ha trovato due geni situati proprio l'uno accanto all'altro, che hanno chiamato ncox e pnox. Questi geni producevano enzimi che apparivano simili al famoso NicA2, ma erano abbastanza distinti da suggerire che si fossero evoluti separatamente.

Per capire come funzionassero questi enzimi, il team li ha prodotti in laboratorio utilizzando batteri E. coli e li ha osservati in azione. Hanno osservato che quando l'enzima Ncox incontrava la nicotina, passava dal giallo al trasparente quasi istantaneamente, un segno visivo che stava cambiando chimicamente la nicotina. L'enzima Pnox faceva la stessa cosa quando incontrava la pseudoossinicotina, una sostanza che si forma naturalmente quando il primo prodotto della degradazione della nicotina resta esposto all'aria. Fondamentalmente, nessuno dei due enzimi aveva bisogno di una proteina partner per farlo; lavoravano direttamente con l'ossigeno dell'aria. Quando i ricercatori hanno misurato la velocità di questa reazione, hanno scoperto che Ncox poteva elaborare la nicotina a una velocità di 7,7 volte al secondo, mentre Pnox elaborava il suo bersaglio a 3,9 volte al secondo. Questi numeri sono vastamente superiori all'originale NicA2, che riesce a gestire solo circa 0,007 reazioni al secondo quando lasciato lavorare con l'ossigeno da solo.

I ricercatori hanno anche esaminato come questi enzimi gestiscono la molecola di ossigeno stessa. In un processo chiamato cinetica transitoria, hanno mescolato gli enzimi con l'ossigeno in una macchina a flusso rapido per misurare l'esatta velocità della reazione. Hanno scoperto che Ncox e Pnox reagiscono con l'ossigeno a velocità di 51.100 e 81.000 per secondo per unità di concentrazione, rispettivamente. Queste velocità sono paragonabili ad altri enzimi altamente efficienti in natura che sono noti come veri ossidanti, e sono migliaia di volte più veloci di NicA2. Ciò ha confermato che i nuovi enzimi non sono solo versioni leggermente migliorate del vecchio, ma macchine fondamentalmente diverse progettate dall'evoluzione per lavorare in un ambiente ricco di ossigeno senza bisogno di un partner citocromo.

Per dimostrare che questi enzimi potessero effettivamente sostituire il partner mancante in un sistema biologico, il team ha eseguito un esperimento di salvataggio. Hanno preso un ceppo del batterio originale Pseudomonas putida che era stato modificato geneticamente per privarlo del suo partner citocromo, rendendolo incapace di mangiare la nicotina. Quando hanno fornito a questo batterio reso incapace il gene per il nuovo enzima Ncox, il batterio ha immediatamente recuperato la capacità di crescere sulla nicotina. In effetti, il batterio cresceva più velocemente con il nuovo enzima Ncoma rispetto alla migliore versione di laboratorio evoluta del vecchio NicA2. Ciò ha dimostrato che il nuovo enzima poteva funzionare in modo indipendente ed efficiente in un sistema vivente, bypassando la necessità della complessa macchina cellulare richiesta dall'enzima originale.

Lo studio ha anche rivelato come i batteri regolano questi enzimi. Confrontando l'attività genetica del batterio quando cresceva sulla nicotina rispetto a quando cresceva su una fonte di cibo diversa, i ricercatori hanno visto che i geni per Ncox e Pnox venivano attivati ad alti livelli in presenza di nicotina. Ciò suggerisce che il batterio utilizzi naturalmente questi enzimi per digerire la nicotina quando la incontra nel suo ambiente. L'analisi genetica ha ulteriormente mostrato che questi enzimi probabilmente sono evoluti da un antenato comune presente in altri batteri, ma hanno intrapreso un percorso evolutivo diverso rispetto al NicA2 presente nei batteri del suolo. Mentre il NicA2 rimaneva legato al sistema del citocromo, questi nuovi enzimi del Peribacillus si sono evoluti per utilizzare l'ossigeno direttamente, forse perché l'ambiente specifico che abitano favoriva questo metodo più semplice e veloce.

Le implicazioni di questa scoperta sono significative per il futuro del trattamento della dipendenza. L'obiettivo primario dell'uso di enzimi per trattare la dipendenza da nicotina è eliminare la droga dal sangue abbastanza velocemente da impedire al cervello di percepire l'effetto euforico. L'originale enzima NicA2 era troppo lento per farlo senza richiedere dosi enormi che sarebbero difficili e costose da produrre. Il nuovo enzima Ncox, con la sua capacità di lavorare rapidamente con l'ossigeno, offre una soluzione molto più pratica. È uno strumento naturale e altamente efficiente che non richiede i complessi partner cellulari che limitano le prestazioni dei suoi predecessori. Sebbene i ricercatori sottolineino che l'enzima debba ancora essere sottoposto a ulteriori test per vedere se può essere ottimizzato per l'uso umano, la scoperta fornisce un potente nuovo candidato che la natura ha già perfezionato per lavorare alla velocità necessaria per un effetto terapeutico.