RNA trans-splicing treatment for Duchenne muscular dystrophy

मांसपेशी एक ऊतक है जो शक्ति और मरम्मत के एक नाजुक संतुलन पर निर्मित होती है। एक स्वस्थ शरीर में, डिस्ट्रोफिन (dystrophin) नामक एक विशाल प्रोटीन एक महत्वपूर्ण शॉक एब्जॉर्बर (झटका सहने वाले यंत्र) के रूप में कार्य करता है, जो मांसपेशी फाइबर के आंतरिक ढांचे को उसकी बाहरी झिल्ली से जोड़ता है। यह जुड़ाव मांसपेशियों को खुद को फटने से बचाते हुए संकुचित और शिथिल होने की अनुमति देता है। जब इस प्रोटीन को बनाने के निर्देशों के लिए जिम्मेदार जीन टूट जाता है, तो यह संपर्क विफल हो जाता है। हर हरकत के साथ मांसपेशी फाइबर फटने लगते हैं, जिससे क्षति, निशान (स्कारिंग) और कमजोरी का एक निरंतर चक्र शुरू हो जाता है। यह डचेन मस्कुलर डिस्ट्रोफी (Duchenne muscular dystrophy) के रोगियों की वास्तविकता है, जो एक गंभीर स्थिति है जो मुख्य रूप से लड़कों को प्रभावित करती है और चलने की क्षमता के नुकसान और अंततः हृदय एवं फेफड़ों की विफलता की ओर ले जाती है। दशकों से, वैज्ञानिकों ने एक हानिरहित वायरस का उपयोग करके एक काम करने वाली प्रति (working copy) को डिलीवर करने की कोशिश की है, लेकिन वायरस की एक सख्त आकार सीमा होती है; यह केवल एक छोटा पैकेज ही ले जा सकता है। पूर्ण-लंबाई वाले डिस्ट्रोफिन प्रोटीन को बनाने के निर्देश एक एकल वायरल ट्रक के अंदर फिट होने के लिए बहुत बड़े हैं, जिससे शोधकर्ताओं को या तो प्रोटीन के एक छोटे, कम प्रभावी संस्करण को भेजने के लिए मजबूर होना पड़ता है या शरीर के भीतर ही निर्देशों को जोड़ने (splice) का प्रयास करना पड़ता है, एक ऐसी प्रक्रिया जो अक्सर अव्यवस्थित या अक्षम रही है।

साल्क इंस्टीट्यूट (Salk Institute) के शोधकर्ताओं की एक टीम ने इस आकार की सीमा को पार करने का एक नया तरीका विकसित किया है, जो स्वस्थ डिस्ट्रोफिन बनाने के पूर्ण, बिना कटे निर्देशों को पहुँचाने का एक संभावित मार्ग प्रदान करता है। एक छोटे ट्रक में एक विशाल पैकेज को जबरदस्ती डालने के बजाय, उन्होंने निर्देशों को तीन छोटे टुकड़ों में विभाजित किया और एक ऐसी प्रणाली डिजाइन की जो कोशिका की अपनी आंतरिक मशीनरी को उन्हें पूरी तरह से वापस जोड़ने की अनुमति देती है। वे इस प्रणाली को आरएनए एंड-जॉइनिंग (RNA End-Joining), या आरईजे (REJ) कहते हैं। इस दृष्टिकोण में, आनुवंशिक निर्देशों को अलग-अलग खंडों में विभाजित किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक को अपने स्वयं के वायरल वेक्टर द्वारा ले जाया जाता है। एक बार मांसपेशी कोशिका के भीतर पहुँचने के बाद, इन खंडों को आरएनए (RNA) में ट्रांसक्राइब किया जाता है, जो आनुवंशिक कोड की एक अस्थायी प्रति है। शोधकर्ताओं ने इन आरएनए टुकड़ों के सिरों पर विशेष आणविक टैग जोड़े, जो एक ज़िप की तरह कार्य करते हैं जो उन्हें एक-दूसरे को खोजने के लिए प्रोत्साहित करते हैं। जब कोशिका की प्राकृतिक स्प्लिसिंग (splicing) मशीनरी इन टैग किए गए टुकड़ों का सामना करती है, तो वह उन्हें एक एकल निरंतर संदेश के रूप में पहचानती है और उन्हें आपस में जोड़ देती है, जिससे पूर्ण-लंबाई वाले प्रोटीन को बनाने के लिए निर्देशों का एक पूर्ण, त्रुटिहीन सेट तैयार होता है। यह विधि विदेशी एंजाइमों या बैक्टीरिया के प्रोटीनों की आवश्यकता को समाप्त करती है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर सकते हैं, और पूरी तरह से शरीर के अपने उपकरणों पर उपचार को असेंबल करने के लिए निर्भर करती है।

यह परीक्षण करने के लिए कि क्या यह प्रणाली जीवित जीव में काम करती है, शोधकर्ताओं ने उन चूहों का उपयोग किया जिनमें मानव डचेन मस्कुलर डिस्ट्रोफी में पाए जाने वाले समान आनुवंशिक दोष मौजूद थे। उन्होंने अपने उपचार के तीन अलग-अलग संस्करणों को डिजाइन किया ताकि यह देखा जा सके कि यह प्रणाली विभिन्न चिकित्सीय लक्ष्यों को कितनी अच्छी तरह संभाल सकती है। एक प्रयोग में, उन्होंने इस प्रणाली का उपयोग 'एबे8ई' (Abe8e) नामक एक जीन-एडिटिंग टूल को डिलीवर करने के लिए किया, जिसे सीधे टूटे हुए जीन को ठीक करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। दूसरे में, उन्होंने डिस्ट्रोफिन के एक थोड़े छोटे लेकिन अत्यधिक कार्यात्मक संस्करण, जिसे डीपी253 (Dp253) के रूप में जाना जाता है, को डिलीवर करने के लिए इसका उपयोग किया। अंत में, उन्होंने तीन वायरल वेक्टर्स का उपयोग करके पूर्ण-लंबाई वाले, मूल डिस्ट्रोफिन प्रोटीन के निर्देशों को डिलीवर करके इस प्रणाली को उसकी चरम सीमा तक पहुँचाया, जो उपचार के लिए स्वर्ण मानक (gold standard) है लेकिन पहले कभी एक एकल वायरल वेक्टर द्वारा डिलीवर करने योग्य नहीं माना गया था। परिणाम आश्चर्यजनक थे। जीन एडिटर से उपचारित चूहों में, प्रणाली ने मांसपेशी फाइबर के एक महत्वपूर्ण हिस्से में पूर्ण-लंबाई वाले प्रोटीन के उत्पादन को सफलतापूर्वक बहाल कर दिया। डीपी253 रिप्लेसमेंट प्राप्त करने वाले चूहों में, उपचार ने प्रोटीन के स्तर को स्वस्थ चूहों में देखे जाने वाले स्तर के लगभग 72 प्रतिशत तक बहाल कर दिया। सबसे प्रभावशाली बात यह थी कि ट्रिपल-वेक्टर प्रणाली ने पूर्ण-लंबाई वाले प्रोटीन को सफलतापूर्वक डिलीवर किया, जो सामान्य के लगभग 11.6 प्रतिशत तक पहुँच गया, जो इतने कठिन वितरण कार्य के लिए एक पर्याप्त मात्रा है।

शोधकर्ताओं ने केवल यह मापने पर ही नहीं रुक गए कि कितना प्रोटीन बना, बल्कि उन्होंने यह भी देखा कि मांसपेशी में वास्तव में क्या बदलाव आए। उन्नत कंप्यूटर विज़न और मशीन लर्निंग का उपयोग करते हुए, उन्होंने उपचारित और अनुपचारित चများနှင့် 120,000 से अधिक व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर का विश्लेषण किया। इस हाई-टेक दृष्टिकोण ने उन्हें उन विवरणों को देखने की अनुमति दी जो मानवीय आँखें मिस कर सकती हैं, जैसे कि कोशिका केंद्रक (cell nuclei) का सटीक स्थान और सूजन संबंधी कोशिकाओं की उपस्थिति। अनुपचारित चूहों में, मांसपेशी फाइबर अक्सर विकृत आकार के थे, जिसमें केंद्रक कोशिका के किनारे के बजाय केंद्र में तैर रहे थे, और ऊतक सूजन और क्षति के संकेतों से भरा हुआ था। उपचारित चूहों में, बीमारी के ये संकेत गायब हो गए। मांसपेशी फाइबर अपने स्वस्थ आकार में लौट आए, केंद्रक अपनी उचित स्थिति में वापस आ गए, और सूजन कम हो गई। उपचारित मांसपेशियां अधिक मजबूत भी हो गईं, जो उत्तेजित होने पर काफी अधिक बल उत्पन्न करती हैं। उपचार प्राप्त करने वाले चूहे व्यायाम पहियों (exercise wheels) पर बहुत अधिक दूर तक दौड़ने में सक्षम थे, जो स्वस्थ जानवरों के व्यवहार के समान स्वैच्छिक गतिविधि की वापसी को दर्शाता है।

एक सबसे आश्चर्यजनक खोज तब मिली जब शोधकर्ताओं ने देखा कि उपचारित और अनुपचारित फाइबर एक-दूसरे के साथ कैसे परस्पर क्रिया करते हैं। जिन चूहों में जीन एडिटर से उपचार किया गया था, उनमें से हर एक मांसपेशी फाइबर को सुधार नहीं मिला; परिणाम स्वस्थ, सुधारे गए फाइबर और बिना सुधारे गए फाइबर का एक मोज़ेक (mosaic) था। शोधकर्ताओं ने पाया कि बिना सुधारे गए फाइबर भी तब अधिक स्वस्थ थे जब वे सुधारे गए पड़ोसियों से घिरे होते थे। यह सुझाव देता है कि एक स्वस्थ मांसपेशी फाइबर अपने क्षतिग्रस्त पड़ोसियों के लिए एक सुरक्षात्मक बफर (protective buffer) प्रदान कर सकता है, जिससे पूरे ऊतक को स्थिर करने में मदद मिलती है, भले ही हर एक कोशिका में मरम्मत पूर्ण न हो। यह खोज यह समझाने में मदद करती है कि क्यों बीमारी की कुछ महिला वाहक (carriers), जिनमें स्वाभाविक रूप से स्वस्थ और दोषपूर्ण मांसपेशी फाइबर का मिश्रण होता है, अक्सर लक्षणहीन रहती हैं। अध्ययन ने यह भी पुष्टि की कि प्रणाली अत्यधिक विशिष्ट थी, जिसमें आरएनए टुकड़ों के गलत आनुवंशिक लक्ष्यों से गलती से जुड़ने का कोई प्रमाण नहीं मिला, जो एक सुरक्षा चिंता है जिसने अन्य जीन थेरेपी दृष्टिकोणों को परेशान किया है।

शोधकर्ताओं ने अपने नए तरीके की तुलना मौजूदा रणनीतियों से की जो बड़े जीन को डिलीवर करने का प्रयास करती हैं। अन्य दृष्टिकोण अक्सर डीएनए या आरएनए को काटने और जोड़ने के लिए बैक्टीरिया के एंजाइमों पर निर्भर करते हैं, जो अनचाहे आणविक निशान छोड़ सकते हैं या प्रतिरक्षा प्रणाली को सक्रिय कर सकते हैं। इसके विपरीत, आरईजे (REJ) प्रणाली, कोशिका के अपने स्प्लिसिंग तंत्र का उपयोग करके एक निर्बाध, निशान-मुक्त प्रोटीन बनाती है। हालांकि इस प्रणाली को यह सुनिश्चित करने के लिए वायरस की उच्च खुराक की आवश्यकता होती है कि पर्याप्त कोशिकाओं को सभी आवश्यक टुकड़े प्राप्त हों, शोधकर्ताओं ने गणना की कि यह खुराक नैदानिक उपयोग के लिए सुरक्षित सीमाओं के भीतर है। यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि ऐसे विशाल चिकित्सीय प्रोटीन डिलीवर करना संभव है जिन्हें पहले वायरल डिलीवरी के लिए बहुत बड़ा माना जाता था। पूर्ण-लंबाई वाले डिस्ट्रोफिन प्रोटीन को सफलतापूर्वक डिलीवर करके और मांसपेशी स्वास्थ्य और कार्य में मजबूत सुधार देखकर, टीम ने दिखाया है कि यह प्लेटफॉर्म न केवल डचेन मस्कुलर डिस्ट्रोफी के इलाज के लिए, बल्कि संभावित रूप से बहुत बड़े, जटिल प्रोटीन के कारण होने वाले अन्य आनुवंशिक रोगों के लिए भी एक व्यवहार्य मार्ग हो सकता है। यह कार्य क्षेत्र को एक ऐसे उपचार के करीब ले जाता है जो केवल एक आंशिक सुधार के बजाय मांसपेशी के पूर्ण, प्राकृतिक कार्य को बहाल करता है।