RNA trans-splicing treatment for Duchenne muscular dystrophy

筋肉は、強さと修復の繊細なバランスの上に築かれた組織です。健康な体内では、ジストロフィンという巨大なタンパク質が重要なショックアブソーバーとして機能し、筋線維の内部の足場と外側の膜を連結しています。この結合により、筋肉は自らを破壊することなく収縮と弛緩を行うことができます。このタンパク質を作るための指示を与える遺伝子が壊れていると、この連結が失敗します。筋肉の線維は動くたびに裂け始め、損傷、瘢痕化、そして衰弱という絶え間ないサイクルへとつながります。これが、主に男児に影響を及ぼし、歩行能力の喪失、そして最終的には心肺不全に至る深刻な疾患であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの人々が直面している現実です。数十年にわたり、科学者たちは無害なウイルスを配送トラックとして使い、機能する遺伝子のコピーを届けることでこれを解決しようと試みてきました。しかし、ウイルスには厳格なサイズ制限があり、小さな荷物しか運ぶことができません。完全長のジストロフィンタンパク質を作るための指示はあまりに巨大で、単一のウイルスのトラックには収まりきらないため、研究者たちは、短縮された効果の低いバージョンのタンパク質を送るか、あるいは体内で指示を繋ぎ合わせる方法を試さざるを得ませんでした。しかし、そのプロセスはしばしば乱雑で非効率的でした。

サーク研究所の研究チームは、このサイズ制限を克服する新しい方法を開発し、完全で、途切れることのない健康なジストロフィンの製造指示を届けるための潜在的な道筋を提示しました。巨大な荷物を小さなトラックに無理やり押し込もうとする代わりに、彼らは指示を3つの小さな断片に分割し、細胞自身の内部機構によってそれらを完璧に縫い合わせることができるシステムを設計しました。彼らはこのシステムを「RNAエンドジョイニング（RNA末端結合法）」、またはREJと呼んでいます。この手法では、遺伝的な指示が別々のセグメントに分割され、それぞれが独自のウイルスベクターによって運ばれます。細胞内に侵入すると、これらのセグメントはRNA、つまり遺伝コードの一時的なコピーへと転写されます。研究者たちは、これらのRNA断片の末端に、互いに見つけやすくするためのジッパーのように機能する特殊な分子タグを加えました。細胞の自然なスプライシング機構がこれらのタグ付きの断片に遭遇すると、それらを一つの連続したメッセージとして認識し、結合させ、完全で欠陥のないフルレングスのタンパク質を作るための完全な指示セットを作り出します。この方法は、免疫反応を引き起こす可能性のある外来の酵素や細菌タンパク質を必要とせず、組み立てに身体自身のツールを完全に利用しています。

このシステムが生存している動物に対して機能するかどうかをテストするために、研究者たちは、ヒトのデュシェンヌ型筋ジストロフィーに見られるものと同じ遺伝的欠陥を持つマウスを用いました。彼らは、さまざまな治療目標をどの程度処理できるかを確認するために、3つの異なるバージョンの治療法を設計しました。一つの実験では、壊れた遺伝子を直接修正するように設計されたAbe8eと呼ばれる遺伝子編集ツールを届けるためにこのシステムを使用しました。別の実験では、少し短いが依然として高い機能を持つDp253として知られるジストロフィン・バリアントを届けるために使用しました。最後に、彼らは3つのウイルスベクターを使用して完全長かつ天然のジストロフィンタンパク質を作るための指示を届けることで、システムの限界を押し広げました。これは、治療におけるゴールドスタンダードですが、これまで単一のウイルスベクターによって届けられたことはありませんでした。結果は驚くべきものでした。遺伝子編集剤を与えられたマウスでは、システムが筋線維のかなりの部分において完全長のタンパク質の生成を正常に回復させました。Dp253置換を受けたマウスでは、タンパク質レベルが健康なマウスの約72パーセントまで回復しました。最も印象的だったのは、トリプルベクター・システムが完全長のタンパク質を届け、約11.6パーセントの正常値に達したことです。これは、このような困難なデリバリー作業としては相当な量です。

研究者たちは、単にどれだけのタンパク質が作られたかを測定するだけでなく、筋肉自体がどのように変化したかを詳細に観察しました。高度なコンピュータビジョンと機械学習を用いて、治療を受けたマウスと受けていないマウスから12万個以上の個別の筋線維を分析しました。このハイテクなアプローチにより、人間の目では見逃してしまうような詳細、例えば細胞核の正確な位置や炎症細胞の存在などを捉えることができました。未治療のマウスでは、筋線維はしばしば形が崩れ、核が細胞の端に収まるのではなく中央に浮いており、組織は炎症と損傷の兆候に満ちていました。治療を受けたマウスでは、これらの疾患の兆候は消失していました。筋線維は健康な形状に戻り、核は適切な位置に移動し、炎症は沈静化しました。治療された筋肉はより強くなり、刺激を与えると大幅に多くの力を発生させました。治療を受けたマウスは、エクササイズホイール上でより長く走ることができ、健康な動物の行動を反映した自発的な活動の回復を示しました。

最も驚くべき発見の一つは、治療された線維と未治療の線維が互いにどのように相互作用しているかを見た時に得られました。遺伝子編集剤を用いたマウスでは、すべての筋線維が修正を受けたわけではなく、その結果は、修正された線維と修正されていない線維が混在したモザイク状となりました。研究者たちは、修正されていない線維が、周囲に修正された隣接線維がある場合に、より健康的であることを発見しました。これは、健康な筋線維が損傷した隣人を保護するバッファーを提供し、たとえ個々の細胞における修復が完璧でなくても、組織全体を安定させる助けとなることを示唆しています。この発見は、なぜ疾患の女性キャリア（保因者）が、自然に健康な線維と欠陥のある線維の混合状態にあるにもかかわらず、多くの場合において無症状でいられるのかを説明する助けとなります。また、本研究は、システムが高い特異性を持ち、RNA断片が誤った遺伝ターゲットに偶然付着することはないことも確認しました。これは、他の遺伝子治療アプローチを悩ませてきた安全性に関する懸念事項です。

研究者たちは、大きな遺伝子を届けようとする既存の戦略と比較を行いました。他のアプローチは、DNAやRNAを切り貼りするために細菌由来の酵素を利用することが多く、それは望まない分子の傷跡を残したり、免疫系を刺激したりすることがあります。対照的に、REJシステムは、細胞自身のスプライシング機構を使用して、シームレスで傷のないタンパク質を作り出します。このシステムは、十分な数の細胞がすべての必要な断片を受け取ることを確実にするために、より高用量のウイルスを必要としますが、研究者たちは、この用量が臨床使用における安全な範囲内に留まっていると算出しました。この研究は、ウイルスによるデリバリーには大きすぎると以前は考えられていた、巨大な治療用タンパク質を届けることが可能であることを示しています。完全長のジストロフィンタンパク質を届けることに成功し、筋肉の健康と機能の力強い改善を確認したことで、チームは、このプラットフォームがデュシェンヌ型筋ジストロフィーだけでなく、非常に巨大で複雑なタンパク質の変異によって引き起こされる他の遺伝性疾患に対しても、実行可能な道筋となり得ることを証明しました。この研究は、部分的な修正ではなく、筋肉の完全かつ自然な機能を回復させる治療へと、この分野を前進させています。