RNA trans-splicing treatment for Duchenne muscular dystrophy

肌肉是一种建立在力量与修复的微妙平衡之上的组织。在健康的身体中，一种被称为抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的巨大蛋白质充当着关键的缓冲器，将肌肉纤维的内部支架与其外部膜连接在一起。这种连接使得肌肉能够在收缩和舒张时不会自我撕裂。当提供制造这种蛋白质指令的基因发生故障时，这种连接就会失效。肌肉纤维会在每一次运动中开始撕裂，导致损伤、瘢痕形成和虚弱的无休止循环。这就是杜兴氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy）患者面临的现实，这是一种主要影响男孩的严重疾病，会导致行走能力的丧失，并最终导致心肺衰竭。几十年来，科学家们一直试图通过使用一种无害的病毒作为“运输卡车”来递送一份有效的基因副本，以此来解决这个问题。然而，病毒有着严格的大小限制；它只能携带很小的包裹。制造全长抗肌萎缩蛋白的指令过于庞大，无法装进单个病毒卡车内，这迫使研究人员要么发送一个缩短的、效果较差的蛋白质版本，要么尝试在体内对指令进行拼接，而这个过程往往是混乱或低效的。

来自索尔克研究所（Salk Institute）的一个研究小组开发了一种克服这一尺寸限制的新方法，为递送制造健康抗肌萎缩蛋白的完整、未经剪裁的指令提供了一条潜在路径。他们没有尝试将巨大的包裹强行塞进小卡车，而是将指令拆分为三个较小的部分，并设计了一个系统，允许细胞自身的内部机制将其完美地缝合在一起。他们将这一系统称为 RNA 末端连接（RNA End-Joining，简称 REJ）。在这种方法中，遗传指令被分为不同的片段，每个片段由各自的病毒载体携带。一旦进入肌肉细胞，这些片段会被转录成 RNA，即遗传密码的临时副本。研究人员在这些 RNA 片段的末端添加了特殊的分子标签，就像拉链一样，鼓励它们相互寻找。当细胞天然的剪接机制遇到这些带有标签的片段时，它会将它们识别为一个连续的完整信息并将其连接起来，从而创造出一套用于制造全长蛋白质的完整且完美的指令集。这种方法避免了使用可能引发免疫反应的外源酶或细菌蛋白，而是完全依赖人体自身的工具来组装这种疗法。

为了测试该系统在活体动物中是否有效，研究人员使用了携带人类杜兴氏肌营养瘾症所见相同遗传缺陷的小鼠。他们设计了三种不同版本的治疗方案，以观察该系统处理各种治疗目标的能力。在一项实验中，他们使用该系统递送了一种名为 Abe8e 的基因编辑工具，该工具旨在直接纠正受损的基因。在另一项实验中，他们递送了一个稍短但仍具有高度功能的抗肌萎缩蛋白版本，称为 Dp253。最后，他们通过使用三个病毒载体来递送全长天然抗肌萎缩蛋白的指令，挑战了系统的极限，因为这是最理想的治疗方案，但此前从未有过通过单个病毒载体进行递送的先例。结果令人瞩目。在接受基因编辑处理的小鼠中，该系统成功地在很大一部分肌肉纤维中恢复了全长蛋白质的产生。在接受 Dp253 替代疗法的小鼠中，治疗将蛋白质水平恢复到了健康小鼠水平的近 72%。最令人印象深刻的是，三载体系统成功递送了全长蛋白质，达到了正常水平的约 11.6%，对于如此困难的递送任务而言，这是一个实质性的进展。

研究人员并没有止步于仅仅测量蛋白质的产量，他们还仔细观察了肌肉本身的变化。利用先进的计算机视觉和机器学习技术，他们分析了超过 12 万个来自受治疗和未受治疗小鼠的单个肌肉纤维。这种高科技方法使他们能够看到人类肉眼可能忽略的细节，例如细胞核的精确位置以及炎症细胞的存在。在未受治疗的小鼠中，肌肉纤维通常形状畸形，细胞核漂浮在细胞中心而非贴近边缘，且组织中充满了炎症和损伤的迹象。在接受治疗的小鼠中，这些疾病迹象消失了。肌肉纤维恢复了健康的形状，细胞核回到了正确的位置，炎症也消退了。受治疗的肌肉也变得更强壮，在受到刺激时能产生显著更多的力量。接受治疗的小鼠在运动轮上能跑得更远，表现出了与健康动物相似的自主活动能力。

一个最令人惊讶的发现来自于观察受治疗和未受治疗的纤维如何相互作用。在接受基因编辑处理的小鼠中，并非每一个肌肉纤维都得到了纠正；结果呈现出一种健康、已纠正的纤维与未纠正的纤维混合在一起的“马赛克”现象。研究人员发现，当未纠正的纤维被纠正的邻居包围时，它们会变得更加健康。这表明，健康的肌肉纤维可以为受损的邻居提供保护性缓冲，即使修复在每一个细胞中并不完美，也能帮助稳定整个组织。这一发现有助于解释为什么一些女性携带者（她们天生拥有混合了健康和缺陷肌肉纤维的身体）通常不会出现症状。研究还证实，该系统具有高度的特异性，没有证据表明 RNA 片段会意外地粘附到错误的遗传目标上，而这曾是困扰其他基因疗法的安全隐忧。

研究人员将他们的新方法与现有的尝试递送大型基因的策略进行了比较。其他方法通常依赖细菌酶来切割和粘贴 DNA 或 RNA，这可能会留下不必要的分子瘢痕或触发免疫系统。相比之下，REJ 系统利用细胞自身的剪接机制来创造一个无缝、无瘢痕的蛋白质。虽然该系统需要更高剂量的病毒以确保足够多的细胞接收到所有必要的片段，但研究人员计算出，该剂量仍处于临床使用的安全限度内。这项研究证明，递送此前被认为过于庞大而无法通过病毒递送的巨型治疗性蛋白质是可能的。通过成功递送全长抗肌萎缩蛋白并观察到肌肉健康和功能的显著改善，团队展示了该平台可以成为治疗不仅仅是杜兴氏肌营养不良症，甚至可能是由极其庞大且复杂的蛋白质引起的其他遗传性疾病的有效途径。这项工作使该领域离实现一种能够恢复肌肉完整自然功能的疗法又近了一步，而不仅仅是提供一个部分的修补。