Stepwise direct reprogramming of adult human dermal fibroblasts into tendon-like cells via transcription factor optimization and 3D culture
यह अध्ययन प्रदर्शित करता है कि ट्रांसक्रिप्शन कारकों (SCX, MKX, MYCL, और OCT3/4) के एक अनुकूलित संयोजन और 3D कल्चर का उपयोग करके वयस्क मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट्स को टेंडन जैसी कोशिकाओं में सीधे पुनर्गठित करना, बाल चिकित्सा सर्जिकल पुनर्निर्माण के लिए ऑटोलॉगस मांसपेशी-टेंडन कंस्ट्रक्ट उत्पन्न करने के लिए एक आशाजनक रणनीति बनाता है।
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पीडियाट्रिक सर्जरी (बाल चिकित्सा सर्जरी) की दुनिया में, डायाफ्राम (वह मांसपेशी जो छाती को पेट से अलग करती है और हमें सांस लेने में मदद करती है) में छेद की मरम्मत करना एक उच्च-जोखिम वाली चुनौती है। जब दोष इतना बड़ा होता है कि उसे केवल टांके लगाकर बंद नहीं किया जा सकता, तो सर्जन अक्सर विस्तारित पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन जैसे पदार्थों से बने सिंथेटिक पैच पर भरोसा करते हैं। हालांकि ये कृत्रिम शीट शरीर को अल्पकाल के लिए एक साथ थामे रख सकती हैं, लेकिन इनमें एक गंभीर खामी है: वे निर्जीव पदार्थ हैं। वे बढ़ नहीं सकते, वे बच्चे के बढ़ते शरीर के अनुकूल नहीं हो सकते, और समय के साथ उनमें संक्रमण या कैल्सीफिकेशन (कैल्सीफिकेशन) का जोखिम रहता है। डॉक्टरों का अंतिम लक्ष्य इन स्थिर पैच को जीवित ऊतकों से बदलना है जिन्हें बच्चा स्वीकार कर सके और जो उनके साथ बढ़ सकें। इसे प्राप्त करने के लिए, वैज्ञानिक 'डायरेक्ट रीप्रोग्रामिंग' नामक एक विधि की खोज कर रहे हैं। इस प्रक्रिया में शरीर के एक हिस्से से एक परिपक्व, विशिष्ट कोशिका को लेना और उसे पूरी तरह से एक अलग प्रकार की कोशिका में बदलने के लिए नए निर्देश देना शामिल है, जिससे स्टेम सेल बनाने की आवश्यकता को दरकिनार किया जा सके। शोधकर्ता खुद से यह सवाल पूछ रहे हैं कि क्या वे एक सामान्य त्वचा कोशिका को टेंडन (कंडरा) कोशिका में बदल सकते हैं, जो डायाफ्राम का एक महत्वपूर्ण घटक है, ताकि एक जीवित, बढ़ते हुए रिपेयर का निर्माण किया जा सके।
क्योटो प्रिफेक्चरल यूनिवर्सिटी ऑफ मेडिसिन के शोधकर्ताओं की एक टीम ने वयस्क मानव त्वचा कोशिकाओं को टेंडन जैसी कोशिकाओं में बदलने का प्रयास करके इस प्रश्न का उत्तर देने के लिए कदम उठाया। उन्होंने वयस्क मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट (adult human dermal fibroblasts) से शुरुआत की, जो त्वचा में पाए जाने वाले कार्यशील कोशिकाएं हैं जो कोलेजन का उत्पादन करती हैं और ऊतक संरचना को बनाए रखती हैं। ये कोशिकाएं प्रचुर मात्रा में होती हैं और रोगी से आसानी से प्राप्त की जा सकती हैं, जो उन्हें एक आदर्श शुरुआती बिंदु बनाती हैं। वैज्ञानिकों ने एक हानिरहित वायरस का उपयोग करके इन त्वचा कोशिकाओं में विशिष्ट जीन का समूह पेश किया। ये जीन 'मास्टर स्विच' या ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर्स के रूपست कार्य करते हैं जो कोशिका को बताते हैं कि कौन से प्रोटीन बनाने हैं और उसे क्या काम करना है। प्रारंभ में, टीम ने छह अलग-अलग कारकों के संयोजन का परीक्षण किया, जिनमें कुछ टेंडन विकास को प्रेरित करने वाले ज्ञात कारक थे और अन्य कोशिकाओं को अधिक लचीला और परिवर्तन के लिए तैयार करने के लिए उपयोग किए गए थे। वे यह देखना चाहते थे कि क्या यह 'कॉकटेल' त्वचा कोशिकाओं को अपनी मूल पहचान भूलने और एक 'टेनोब्लास्ट' (tenoblast) के गुणों को अपनाने के लिए मजबूर कर सकता है, जो कि एक ऐसी कोशिका है जो टेंडन का निर्माण और रखरखाव करती है।
प्रयोग ने दिखाया कि छह-कारक वाला संयोजन काम कर गया। त्वचा कोशिकाओं ने टेनोमोडुलिन (tenomodulin) और थ्रोम्बोस्पोंडिन-4 (thrombospondin-4) का उच्च स्तर उत्पादन करना शुरू कर दिया, जो टेंडन कोशिकाओं के स्पष्ट मार्कर के रूप में कार्य करते हैं। जब शोधकर्ताओं ने सूक्ष्मदर्शी के नीचे कोशिकाओं को देखा, तो उन्होंने एक भौतिक परिवर्तन देखा। मूल त्वचा कोशिकाएं छोटी और स्पिंडल के आकार की थीं, लेकिन पुनर्गठित कोशिकाएं फैल गईं, लंबी और पतली हो गईं, जो एक वास्तविक टेंडन के रेशों के समान थीं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ये नई कोशिकाएं स्थिर रहें, टीम ने उन्हें चूहों की त्वचा के नीचे रखा। एक सप्ताह के भीतर, कोशिकाओं ने जीवित रहकर ग्राफ्ट में छोटे समूहों का निर्माण किया, जिससे सिद्ध हुआ कि पुनर्गठित कोशिकाएं एक जीवित शरीर में बिना तुरंत मरे या सूजन पैदा किए रह सकती हैं। इस प्रारंभिक सफलता ने पुष्टि की कि अवधारणा व्यवहार्य थी, लेकिन टीम जानती थी कि छह कारकों का उपयोग करना आवश्यक से अधिक जटिल था। वे समान परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे सरल, सबसे कुशल नुस्खा खोजना चाहते थे।
उन्मूलन की प्रक्रिया के माध्यम से, शोधकर्ताओं ने आवश्यक कारकों के न्यूनतम सेट को खोजने के लिए विभिन्न संयोजनों का परीक्षण किया। उन्होंने पाया कि चार कारक पर्याप्त थे: SCX, MKX, OCT3/4, और MYCL। अध्ययन से पता चला कि इन प्रत्येक कारकों ने परिवर्तन में एक विशिष्ट भूमिका निभाई। एक कारक, OCT3/4, टेनोमोडुलिन के जीन को चालू करने के लिए आवश्यक था, जबकि एक अन्य, SCX, थ्रोम्बोस्पोंडिन-4 के उत्पादन के लिए प्राथमिक चालक था। अन्य दो कारकों ने प्रक्रिया को सुचारू और कुशल बनाने में मदद की। यह खोज महत्वपूर्ण थी क्योंकि इसने प्रक्रिया को सरल बना दिया, जिससे वांछित कोशिका प्रकार बनाने के लिए आवश्यक आनुवंशिक निर्देशों की संख्या कम हो गई। शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक परिवर्तित कोशिकाओं को "डायरेक्टली कन्वर्टेड टेनोब्लास्ट्स" (directly converted tenoblasts) नाम दिया। उन्होंने पुष्टि की कि ये कोशिकाएं टेंडन कोशिकाओं की तरह दिखती थीं और सही प्रोटीन का उत्पादन करती थीं, भले ही वे त्वचा कोशिकाओं के रूप में शुरू हुई थीं।
टीम ने इसके बाद यह जांचा कि क्या वह वातावरण जिसमें कोशिकाएं विकसित होती हैं, उनके विकास में सुधार कर सकता है। एक सपाट डिश में विकसित कोशिकाएं, जिसे टू-डायमेंशनल कल्चर (two-dimensional culture) कहा जाता है, ने अच्छे परिणाम दिखाए, लेकिन शोधकर्ता यह जानना चाहते थे कि क्या एक अधिक प्राकृतिक, थ्री-डायमेंशनल (त्रि-आयामी) वातावरण मदद करेगा। उन्होंने कुछ परिवर्तित कोशिकाओं को कोलेजन से बनी जेल में एम्बेड किया, जो शरीर के प्राकृतिक ढांचे (scaffolding) की नकल करती है। उन्होंने पाया कि कोशिकाओं को पहले सपाट डिश में कुछ समय बिताने के बाद इस थ्री-डायमेंशनल जेल में स्थानांतरित करने से टेंडन मार्करों की अभिव्यक्ति (expression) में और वृद्धि हुई। विशेष रूप रूप से, जो कोशिकाएं प्रक्रिया के बाद के चरण में जेल में स्थानांतरित की गई थीं, उनमें प्रमुख प्रोटीनों का उच्चतम स्तर देखा गया। इससे पता चला कि कोशिकाओं को जटिल, थ्री-डायमेंशनल संरचना द्वारा उन्हें और अधिक परिपक्व करने में मदद करने से पहले एक सरल वातावरण में अपनी नई पहचान स्थापित करने की आवश्यकता होती है।
हालांकि परिणाम उत्साहजनक थे, शोधकर्ता अपने वर्तमान कार्य की सीमाओं को नोट करने में भी सावधान थे। उन्होंने सफलतापूर्वक ऐसी कोशिकाएं बनाई थीं जो डिश में टेंडन कोशिकाओं की तरह दिखती और व्यवहार करती थीं और चूहों में कुछ समय तक जीवित रहीं, लेकिन उन्होंने अभी तक यह परीक्षण नहीं किया था कि क्या ये कोशिकाएं एक वास्तविक टेंडन के शारीरिक तनाव को सहन कर सकती हैं या क्या वे लंबे समय में एक बढ़ते शरीर में पूरी तरह से एकीकृत हो सकती हैं। अध्ययन ने नए ऊतक की ताकत या यह मानव रोगी में कितनी अच्छी तरह कार्य करेगा, इसका माप नहीं किया। हालांकि, इस कार्य ने एक स्पष्ट, चरण-दर-चरण मार्ग प्रदान किया है। विशिष्ट चार कारकों की पहचान करके और कोशिकाओं को संवर्धित करने के सर्वोत्तम तरीके को जानकर, टीम ने रोगी-विशिष्ट टेंडन ऊतक बनाने के लिए एक आधार तैयार किया है। यह दृष्टिकोण अंततः डायाफ्रामिक हर्निया वाले बच्चों के लिए जीवित, बढ़ते हुए पैच के विकास की ओर ले जा सकता है, जो एक समाधान प्रदान करता है जो एक स्थिर, विदेशी वस्तु रहने के बजाय रोगी के साथ अनुकूलित होता है और बढ़ता है।
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