Stepwise direct reprogramming of adult human dermal fibroblasts into tendon-like cells via transcription factor optimization and 3D culture

Nel mondo della chirurgia pediatrica, riparare un buco nel diaframma — il muscolo che separa il torace dall'addome e ci aiuta a respirare — è una sfida ad alto rischio. Quando il difetto è troppo grande per essere semplicemente ricucito con dei punti, i chirurghi spesso si affidano a patch sintetiche realizzate con materiali come il politetrafluoroetilene espanso. Sebbene questi fogli artificiali possano tenere insieme il corpo nel breve termine, presentano un difetto critico: sono materia morta. Non possono crescere, non si adattano al corpo in espansione di un bambino e comportano rischi di infezione o calcificazione nel tempo. L'obiettivo finale per i medici è sostituire questi patch statici con tessuto vivente che il corpo di un bambino possa accettare e che cresca insieme a lui. Per raggiungere questo scopo, gli scienziati stanno esplorando un metodo chiamato riprogrammazione diretta. Questo processo consiste nel prendere una cellula matura e specializzata da una parte del corpo e dare a questa un nuovo set di istruzioni per trasformarla in un tipo di cellula completamente diverso, saltando la necessità di creare prima le cellule staminali. La domanda che i ricercatori si sono posti è se sia possibile trasformare una comune cellula della pelle in una cellula tendinea, un componente cruciale del diaframma, per costruire una riparazione vivente e in crescita.

Un team di ricercatori della Prefettura Universitaria di Medicina di Kyoto si è posto l'obiettivo di rispondere a questa domanda tentando di trasformare cellule cutanee umane adulte in cellule simili a tendini. Sono partiti da fibroblasti dermici umani adulti, che sono le cellule "da lavoro" presenti nella pelle che producono collagene e mantengono la struttura dei tessuti. Queste cellule sono abbondanti e facili da ottenere da un paziente, il che le rende un punto di partenza ideale. Gli scienziati hanno introdotto un gruppo specifico di geni in queste cellule della pelle utilizzando un virus innocuo. Questi geni agiscono come interruttori principali, o fattori di trascrizione, che dicono alla cellula quali proteine produrre e quale compito svolgere. Inizialmente, il team ha testato una combinazione di sei diversi fattori, tra cui alcuni noti per guidare lo sviluppo del tendine e altri utilizzati per rendere le cellule più flessibili e pronte al cambiamento. Volevano vedere se questo "cocktail" potesse costringere le cellule della pelle a dimenticare la loro identità originale e ad adottare le caratteristiche di un tenoblasto, una cellula che costruisce e mantiene i tendini.

L'esperimento ha dimostrato che la combinazione di sei fattori funzionava. Le cellule della pelle iniziarono a produrre alti livelli di tenomodulina e trombospondina-4, due proteine che fungono da chiari marcatori per le cellule tendinee. Quando i ricercatori osservarono le cellule al microscopio, videro una trasformazione fisica. Le cellule originali della pelle erano corte e a forma di fuso, ma le cellule riprogrammate si allungarono, diventando lunghe e sottili, somigliando alle fibre di un vero tendine. Per garantire la stabilità di queste nuove cellule, il team le inserì sotto la pelle di topi. Entro una settimana, le cellule erano sopravvute e avevano formato piccoli ammassi nel trapianto, dimostrando che le cellule riprogrammate potevano persistere in un corpo vivente senza morire immediatamente o causare infiammazioni. Questo successo iniziale ha confermato che il concetto era percorribile, ma il team sapeva che l'uso di sei fattori era più complesso del necessario. Volevano trovare la ricetta più semplice ed efficiente per ottenere lo stesso risultato.

Attraverso un processo di eliminazione, i ricercatori hanno testato diverse combinazioni di fattori per trovare il set minimo richiesto. Scoprirono che quattro fattori erano sufficienti: SCX, MKX, OCT3/4 e MYCL. Lo studio ha rivelato che ciascuno di questi fattori svolgeva un ruolo distinto nella trasformazione. Un fattore, OCT3/4, era essenziale per attivare il gene della tenomodulina, mentre un altro, SCX, era il driver primario per la produzione di trombospondina-4. Gli altri due fattori aiutavano il processo a procedere in modo fluido ed efficiente. Questa scoperta fu significativa perché semplificò la procedura, riducendo il numero di istruzioni genetiche necessarie per creare il tipo cellulare desiderato. I ricercatori chiamarono queste cellule con successo convertite "tenoblasti direttamente convertiti". Confermarono che queste cellule somigliavano a cellule tendinee e producevano le proteine corrette, nonostante fossero partite come cellule della pelle.

Il team ha poi indagato se l'ambiente in cui le cellule crescevano potesse migliorarne lo sviluppo. Le cellule cresciute in un piatto piatto, nota come coltura bidimensionale, mostrarono buoni risultati, ma i ricercatori si chiesero se un ambiente più naturale, tridimensionale, potesse aiutare. Imbevvero alcune delle cellule convertite in un gel fatto di collagene, un materiale che imita l'impalcatura naturale del corpo. Scoprirono che spostare le cellule in questo gel tridimensionale dopo che avevano già trascorso del tempo nel piatto piatto aumentava ulteriormente l'espressione dei marcatori tendinei. Nello specifico, le cellule che venivano trasferite nel gel in una fase success del processo mostravano i livelli più alti delle proteine chiave. Ciò suggeriva che le cellule avessero bisogno di stabilire la loro nuova identità in un ambiente semplice prima che la struttura tridimensionale complessa potesse aiutarle a maturare ulteriormente.

Sebbene i risultati fossero promettenti, i ricercatori fecero attenzione a sottolineare i limiti del loro attuale lavoro. Avevano creato con successo cellule che sembravano e agivano come cellule tendinee in un piatto e che sopravvivevano per un breve periodo nei topi, ma non avevano ancora testato se queste cellule potessero resistere allo stress fisico di un vero tendine o se potessero integrarsi pienamente in un corpo in crescita a lungo termine. Lo studio non ha misurato la forza del nuovo tessuto o quanto bene avrebbe funzionato in un paziente umano. Tuttavia, il lavoro ha fornito un percorso chiaro e passo dopo passo. Identificando i quattro fattori specifici necessari e il modo migliore per coltivare le cellule, il team ha gettato le basi per la creazione di tessuto tendineo specifico per il paziente. Questo approccio potrebbe portare, in futuro, allo sviluppo di patch viventi e in crescita per i bambini con ernie diaframmatiche, offrendo una soluzione che si adatta e cresce con il paziente invece di rimanere un oggetto estraneo e statico.