Stepwise direct reprogramming of adult human dermal fibroblasts into tendon-like cells via transcription factor optimization and 3D culture

在小儿外科领域，修复横膈膜（分隔胸腔与腹部并帮助我们呼吸的肌肉）上的漏洞是一项高风险的挑战。当缺陷过大而无法简单地缝合时，外科医生通常依赖于由扩展聚四氟乙烯等材料制成的合成补片。虽然这些人工薄片可以在短期内维持身体结构的完整，但它们有一个致命缺陷：它们是死物质。它们无法生长，无法适应儿童不断发育的身体，并且随着时间的推移，会带来感染或钙化的风险。医生的终极目标是用活体组织取代这些静态补片，这种组织必须能被儿童的身体接受，并能随其生长。为了实现这一目标，科学家们正在探索一种称为“直接重编程”的方法。这一过程涉及将身体某一部分成熟的特化细胞赋予一组新的指令，使其转化为完全不同的另一种细胞类型，从而绕过首先创建干细胞的步骤。研究人员一直在探究的问题是，他们是否可以将一种常见的皮肤细胞转化为腱细胞——这是横膈膜的重要组成部分——从而构建出一种活性的、可生长的修复组织。

京都府立医科大学的一个研究小组致力于通过尝试将成年人类皮肤细胞转化为类腱细胞来回答这个问题。他们以成年人类真皮成纤维细胞为起点，这类细胞是皮肤中负责产生胶原蛋白并维持组织结构的“劳模”细胞。这些细胞数量丰富且易于从患者身上获取，使其成为理想的起点。科学家们使用一种无害的病毒将一组特定的基因引入这些皮肤细胞中。这些基因充当“主开关”或转录因子，指示细胞制造哪些蛋白质以及执行什么工作。最初，团队测试了一种包含六种不同因子的组合，其中包括一些已知能驱动腱发育的因子，以及一些用于使细胞更具柔韧性和易于改变的因子。他们想看看这种“鸡尾酒式”的组合能否迫使皮肤细胞忘记其原始身份，并采纳腱细胞（tenoblast，一种构建并维持腱的细胞）的特征。

实验表明，这六因子组合是有效的。皮肤细胞开始大量产生腱模块蛋白（tenomodulin）和血小酸性蛋白-4（thrombospondin-4），这两种蛋白质是腱细胞的明确标志物。当研究人员在显微镜下观察这些细胞时，他们看到了物理形态上的转变。原本的皮肤细胞呈短小的梭形，而重编程后的细胞则拉长变细，看起来像是真实的腱纤维。为了确保这些新细胞是稳定的，团队将它们植入小鼠皮下。在一周内，这些细胞存活了下来并在移植部位形成了微小的细胞簇，证明了重编程后的细胞可以在活体中存活，而不会立即死亡或引起炎症。这一初步成功证实了该概念的可行性，但团队意识到使用六个因子比实际需要的更为复杂。他们希望找到最简单、最高效的配方来实现同样的结果。

通过排除法，研究人员测试了不同因子的组合，以寻找实现相同结果所需的最小集合。他们发现四个因子就足够了：SCX、MKX、OCT3/4 和 MYCL。研究表明，这些因子中的每一个都在转化过程中发挥了独特的作用。其中一个因子 OCT3/4 对于开启腱模块蛋白的基因至关重要，而另一个因子 SCX 则是产生血酸性蛋白-4 的主要驱动力。另外两个因子则帮助整个过程顺利且高效地运行。这一发现意义重大，因为它简化了程序，减少了创造所需细胞类型所需的遗传指令数量。研究人员将这些成功转化的细胞命名为“直接转化腱细胞”。他们确认这些细胞看起来像腱细胞并能产生正确的蛋白质，尽管它们最初是皮肤细胞。

随后，团队调查了细胞生长的环境是否可以改善其发育。在被称为二维培养的平面培养皿中生长的细胞显示出了良好的结果，但研究人员想知道更自然的三维环境是否会有所帮助。他们将部分转化后的细胞嵌入由胶原蛋白制成的凝胶中，这种材料模拟了人体的自然支架。他们发现，在平面培养皿中已经生长了一段时间后，再将细胞转移到这种三维凝胶中，会进一步提升腱标志物的表达水平。具体而言，在过程中较晚阶段转移到凝胶中的细胞表现出了最高的关键蛋白水平。这表明，细胞需要先在一个简单的环境中建立其新身份，然后复杂的、三维的结构才能帮助它们进一步成熟。

尽管结果令人鼓舞，但研究人员谨慎地指出，他们目前的工作存在局限性。他们成功创造了在培养皿中看起来并表现得像腱细胞、且能在小鼠体内存活一段时间的细胞，但尚未测试这些细胞是否能够承受真实腱组织的物理压力，或者是否能在长期内完全整合到生长中的身体里。该研究并未测量新组织的强度，也未测量其在人体内的功能表现。然而，这项工作提供了一条清晰的、循序渐进的前行路径。通过确定所需的特定四个因子以及培养细胞的最佳方式，该团队为创造患者特异性腱组织奠定了基础。这种方法最终可能导致为患有横膈膜疝的儿童开发出活性的、可生长的补片，提供一种能随患者一起适应和生长的解决方案，而不是一个静态的、外来物体。