NISTmAb-Based Small-Scale RP-HPLC Screening for DAR Adjustment in Cysteine Antibody-Drug Conjugation

आधुनिक चिकित्सा की दुनिया में, वैज्ञानिक अक्सर ऐसी दवाएं डिजाइन करते हैं जो गाइडेड मिसाइलों की तरह काम करती हैं। इन्हें एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट्स (antibody-drug conjugates) कहा जाता है। ये दो भागों से बने होते हैं: एक बड़ा प्रोटीन जिसे एंटीबॉडी कहा जाता है, जिसे विशिष्ट कैंसर कोशिकाओं को खोजने और उनसे चिपकने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है, और एक छोटा, शक्तिशाली जहर जिसे ड्रग पेलोड (drug payload) कहते हैं जो एंटीबॉडी द्वारा कोशिका तक पहुँचाए जाने के बाद उसे मार देता है। चुनौती स्वयं वितरण प्रणाली (delivery system) में निहित है। यदि एंटीबॉडी बहुत कम दवाएं ले जाती है, तो उपचार प्रभावी नहीं हो सकता है। यदि वे बहुत अधिक ले जाती हैं, तो दवा लक्ष्य तक पहुँचने से पहले ही अलग हो सकती है या रोगी के लिए बहुत जहरीली हो सकती है। इन दवाओं को सुरक्षित रूप से बनाने के लिए, शोधकर्ताओं को यह नियंत्रित करना होता है कि प्रत्येक एंटीबॉडी से कितनी दवा के अणु जुड़ते हैं। यह संख्या गुणवत्ता का एक महत्वपूर्ण पैमाना है, लेकिन सही संतुलन बनाने के लिए एंटीबॉडी तैयार करने और दवा जोड़ने के तरीके का सावधानीपूर्वक परीक्षण करना आवश्यक है।

जापान और संयुक्त राज्य अमेरिका में अजिनोमोटो (Ajinomoto) के शोधकर्ताओं की एक टीम ने हाल ही में इस समस्या पर काम किया कि इन स्थितियों का कुशलतापूर्वक परीक्षण कैसे किया जाए। उन्होंने वास्तविक कैंसर-विरोधी दवाओं के विकल्प के रूप में NISTmAb नामक एक विशेष, सुप्रसिद्ध एंटीबॉडी का उपयोग किया। यह संदर्भ सामग्री (reference material) एक मानक पैमाने की तरह है जिसका उपयोग दुनिया भर की प्रयोगशालाएं यह जांचने के लिए कर सकती हैं कि उनके उपकरण सही ढंग से काम कर रहे हैं या नहीं। वैज्ञानिकों ने यह देखना चाहा कि क्या वे इस मानक एंटीबॉडी का उपयोग करके यह तेजी से पता लगा सकते हैं कि एक विशिष्ट प्रकार की कैंसर-मारने वाली दवा को जोड़ने की सबसे अच्छी विधि क्या है। उनका लक्ष्य एक सरल, छोटे पैमाने का परीक्षण बनाना था जो अन्य प्रयोगशालाओं को भारी और महंगी सामग्रियों की आवश्यकता के बिना इन जटिल दवाओं को बनाने के लिए अपनी स्वयं की प्रक्रियाओं को स्थापित करने में मदद कर सके।

जिस प्रक्रिया का उन्होंने अध्ययन किया, उसमें एक विशिष्ट रासायनिक तकनीक शामिल है। एंटीबॉडीज को डाइसल्फाइड बॉन्ड (disulfide bonds) नामक मजबूत रासायनिक पुलों द्वारा एक साथ रखा जाता है। दवा जोड़ने के लिए, शोधकर्ता पहले इन पुलों को धीरे से तोड़ते हैं ताकि एंटीबॉडी पर छोटे, खुले हुक बन सकें। इन हुक्स को खोलने के लिए उन्होंने TCEP नामक एक रसायन का उपयोग किया। एक बार जब हुक्स खुल गए, तो उन्होंने दवा को पेश किया, जो एक ऐसे कनेक्टर से जुड़ी थी जिसे उन हुक्स पर फिट होने के लिए डिज़ाइन किया गया था। शोधकर्ताओं ने एंटीबॉडी को तोड़ने वाले रसायन और ड्रग कनेक्टर की विभिन्न मात्राओं के साथ उपचारित किया ताकि यह देखा जा सके कि कितने ड्रग्स चिपकते हैं। उन्होंने यह भी परीक्षण किया कि ड्रग जोड़ने से पहले उन्हें ब्रेकिंग केमिकल (breaking chemical) को काम करने के लिए कितना समय देना चाहिए।

परिणाम देखने के लिए, वैज्ञानिकों ने एक ऐसी मशीन का उपयोग किया जो अणुओं को इस आधार पर अलग करती है कि वे एक तरल पदार्थ के साथ कैसे प्रतिक्रिया करते हैं। यह मशीन, जिसे रिवर्स-फेज हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (reversed-phase high-performance liquid chromatograph) के रूप में जाना जाता है, एक छलनी की तरह कार्य करती है जो एंटीबॉडी को इस आधार पर छाँटती है कि वे कितनी दवाएं ले जा रहे हैं। अधिक दवा ले जाने वाली एंटीबॉडीज इस छलनी से अलग तरह से चिपकती हैं, जिससे शोधकर्ता उनकी गिनती कर पाते हैं। उन्होंने दवाओं का सटीक वजन या कोशिकाओं पर जैविक प्रभाव को नहीं मापा, बल्कि वे इन स्क्रीनिंग अवलोकनों के आधार पर प्रत्येक एंटीबॉडी से जुड़ी दवाओं की औसत संख्या का अनुमान लगा सके।

टीम ने पाया कि ब्रेकिंग केमिकल, TCEP, की मात्रा सबसे महत्वपूर्ण कारक थी। जैसे-जैसे उन्होंने TCEP की मात्रा बढ़ाई, जुड़ी हुई दवाओं की संख्या एक स्थिर, अनुमानित रेखा में बढ़ती गई। यह संबंध तब भी सत्य रहा जब उन्होंने घोल में एंटीबॉडी की सांद्रता (concentration) को बदला। उन्होंने पाया कि एंटीबॉडी की तुलना में लगभग 2.75 गुना TCEP का उपयोग करने से लगातार प्रति एंटीबॉडी लगभग चार ड्रग्स का औसत प्राप्त हुआ। यह एक प्रमुख खोज थी क्योंकि इसने दिखाया कि एक एकल चर (variable) का उपयोग अंतिम परिणाम को ट्यून करने के लिए किया जा सकता है।

इसके बाद, उन्होंने यह देखा कि कितना ड्रग कनेक्टर जोड़ना है। उन्होंने पाया कि एक बार जब उन्होंने कनेक्टर की इतनी मात्रा जोड़ दी जो TCEP द्वारा बनाए गए खुले हुक्स की संख्या के बराबर थी, तो और अधिक कनेक्टर जोड़ने से जुड़ी दवाओं की संख्या में वृद्धि नहीं हुई। सिस्टम एक संतृप्ति बिंदु (saturation point) पर पहुँच गया जहाँ एंटीबॉडी और अधिक दवा नहीं रख सकती थी। इससे उन्हें पता चला कि जुड़ी हुई दवाओं की संख्या उस संख्या पर निर्भर करती है जितने हुक्स खोले गए थे, और अतिरिक्त कनेक्टर जोड़ना आवश्यक नहीं है।

अंत में, उन्होंने परीक्षण किया कि ब्रेकिंग केमिकल को काम करने के लिए कितने समय की आवश्यकता थी। जुड़ी हुई दवाओं की संख्या पहले 30 मिनट में तेजी से बढ़ी और फिर स्थिर हो गई। 45 मिनट तक, प्रक्रिया लगभग पूरी हो गई थी, और अधिक प्रतीक्षा करने से परिणाम में कोई बदलाव नहीं आया। इसने उन्हें प्रतिक्रिया के लिए एक सुविधाजनक 45 मिनट की अवधि चुनने की अनुमति दी, जिससे प्रक्रिया तेज और प्रबंधित करने में आसान हो गई।

इन निष्कर्षों को जोड़कर, शोधकर्ताओं ने विशिष्ट स्थितियाँ स्थापित कीं जो विश्वसनीय रूप से एक औसत चार ड्रग्स ले जाने वाली एंटीबॉडी का उत्पादन करती हैं। उन्होंने 7.5 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर की एंटीबॉडी सांद्रता का उपयोग किया, TCEP की 2.75 गुना मात्रा जोड़ी, इसे 45 मिनट तक प्रतिक्रिया करने दी, और फिर 7.5 गुना ड्रग कनेक्टर जोड़ा। इस संयोजन ने एक सुसंगत परिणाम दिया जिसे अन्य प्रयोगशालाएं शुरुआती बिंदु के रूप में आजमा सकती हैं।

इस कार्य का मूल्य मरीजों के लिए नई दवा बनाने में नहीं है, बल्कि उन प्रयोगशालाओं को एक विश्वसनीय बेंचमार्क प्रदान करने में है जो ऐसा करती हैं। एक सामान्य, अच्छी तरह से परिभाषित एंटीबॉडी का उपयोग करके, विभिन्न प्रयोगशालाएं अब अपने तरीकों की तुलना कर सकती हैं और यह सुनिश्चित कर सकती हैं कि वे सभी इन दवाओं को एक ही तरह से माप और बना रही हैं। यह अध्ययन पुष्टि करता है कि यह लघु-स्तरीय स्क्रीनिंग पद्धति ड्रग लोड को समायोजित करने के लिए अच्छी तरह से काम करती है, जो इन नए एंटीबॉडी उपचारों को विकसित करने वाले वैज्ञानिकों के लिए एक व्यावहारिक उपकरण है। यह प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों को स्थापित करने के लिए एक स्पष्ट, परीक्षित मार्ग प्रदान करता है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि दवा विकास की जटिल मशीनरी एक ठोस आधार के साथ शुरू हो।