NISTmAb-Based Small-Scale RP-HPLC Screening for DAR Adjustment in Cysteine Antibody-Drug Conjugation

Nel mondo della medicina moderna, gli scienziati progettano spesso farmaci che agiscono come missili guidati. Questi sono chiamati coniugati anticorpo-farmaco (antibody-drug conjugates). Essi consistono in due parti: una grande proteina chiamata anticorpo, addestrata per trovare e attaccarsi a specifiche cellule tumorali, e un piccolo, potente veleno chiamato carico utile del farmaco (drug payload) che uccide la cellula una volta che l'anticorpo lo ha consegnato. La sfida risiede nel sistema di consegna stesso. Se l'anticorpo trasporta troppo pochi farmaci, il trattamento potrebbe non funzionare. Se ne trasporta troppi, il farmaco potrebbe staccarsi prima di raggiungere il bersaglio o diventare troppo tossico per il paziente. Per rendere questi medicinali sicuri, i ricercatori devono controllare esattamente quanti quantitativi di molecole di farmaco si attaccano a ogni anticorpo. Questo numero è una misura critica della qualità, ma trovare il giusto equilibrio richiede test attenti su come l'anticorpo viene preparato e su come il farmaco viene attaccato.

Un team di ricercatori presso Ajinomoto in Giappone e negli Stati Uniti ha recentemente affrontato il problema di come testare queste condizioni in modo efficiente. Hanno utilizzato un anticorpo speciale, molto noto, chiamato NISTmAb, come sostituto dei veri farmaci antitumorali. Questo materiale di riferimento è come un righello standard che i laboratori di tutto il mondo possono usare per verificare se i loro strumenti funzionano correttamente. Gli scienziati volevano vedere se potevano utilizzare questo anticorpo standard per determinare rapidamente la migliore ricetta per attaccare un tipo specifico di farmaco antitumorale. Il loro obiettivo era creare un test semplice, su piccola scala, che potesse aiutare altri laboratori a impostare i propri processi per la produzione di questi complessi medicinali senza la necessità di enormi quantità di materiali costosi.

Il processo studiato prevede un particolare trucco chimico. Gli anticorpi sono tenuti insieme da forti ponti chimici chiamati legami disolfuro. Per attaccare il farmaco, i ricercatori hanno prima delicatamente rotto alcuni di questi ponti per creare piccoli ganci aperti sull'anticorpo. Hanno usato una sostanza chimica chiamata TCEP per farlo. Una volta aperti i ganci, hanno introdotto il farmaco, che era collegato tramite un connettore progettato per agganciapparsi a quei ganci. I ricercatori hanno trattato l'anticorpo con diverse quantità della sostezza chimica di rottura e del connettore del farmaco per vedere quanti farmaci si sarebbero attaccati. Hanno anche testato quanto tempo avrebbero dovuto lasciare che la sostanza chimica di rottura agisse prima di aggiungere il farmaco.

Per osservare i risultati, gli scienziati hanno utilizzato una macchina che separa le molecole in base alla loro interazione con un liquido. Questa macchina, nota come cromatografia liquida ad alte prestazioni a fase inversa, agisce come un setaccio che smista gli anticorpi in base al numero di farmaci che trasportano. Gli anticorpi con più farmaci aderiscono al setaccio diversamente rispetto a quelli con meno farmaci, permettendo ai ricercatori di contarli. Non hanno misurato il peso esatto dei farmaci né l'effetto biologico sulle cellule, ma hanno potuto stimare il numero medio di farmaci attaccati a ciascun anticorpo sulla base di queste osservazioni di screening.

Il team ha scoperto che la quantità della sostanza chimica di rottura, il TCEP, era il fattore più importante. Aumentando la quantità di TCEP, il numero di farmaci attaccati saliva in modo costante e prevedibile. Questa relazione rimaneva valida anche quando cambiavano la concentrazione dell'anticorpo nella soluzione. Hanno scoperto che l'utilizzo di circa 2,75 volte la quantità di TCEP rispetto all'anticorpo produceva costantemente una media di circa quattro farmaci per anticorpo. Questa è stata una scoperta fondamentale perché dimostrava che una singola variabile poteva essere utilizzata per regolare il risultato finale.

Successivamente, hanno esaminato quanto connettore del farmaco dovesse essere aggiunto. Hanno scoperto che, una volta aggiunto abbastanza connettore da corrispondere al numero di ganci aperti creati dal TCEP, aggiungerne ancora di più non aumentava il numero di farmaci attaccati. Il sistema raggiungeva un punto di saturazione dove l'anticorpo semplicemente non poteva contenerne altri. Ciò ha indicato che esiste un limite a quanto farmaco può essere attaccato basandosi sul numero di ganci aperti, e che aggiungere connettore in eccesso non è necessario.

Infine, hanno testato quanto tempo la sostanza chimica di rottura dovesse agire. Il numero di farmaci attaccati saliva rapidamente nei primi 30 minuti e poi si stabilizzava. Entro 45 minuti, il processo era essenzialmente completato e attendere più a lungo non cambiava il risultato. Ciò ha permesso loro di selezionare una finestra temporale conveniente di 45 minuti per la reazione, rendendo il processo più veloce e facile da gestire.

Combinando queste scoperte, i ricercatori hanno stabilito un insieme specifico di condizioni che producevano in modo affidabile un anticorpo portatore di una media di quattro farmaci. Hanno utilizzato una concentrazione di anticorpo di 7,5 milligrammi per millilitro, aggiunto 2,75 volte la quantità di TCEP, lasciato reagire per 45 minuti e poi aggiunto 7,5 volte la quantità di connettore del farmaco. Questa combinazione ha prodotto un risultato coerente che altri laboratori potevano provare come punto di partenza.

Il valore di questo lavoro non consiste nel creare un nuovo farmaco per i pazienti, ma nel fornire un parametro di riferimento affidabile per i laboratori che lo fanno. Utilizzando un anticorpo comune e ben caratterizzato, diversi laboratori possono ora confrontare i propri metodi ed assicurarsi di misurare e produrre questi farmaci nello stesso modo. Lo studio conferma che questo metodo di screening su piccola scala funziona bene per regolare il carico di farmaco, offrendo uno strumento pratico agli scienziati che stanno sviluppando nuovi trattamenti anticorpali. Esso fornisce un percorso chiaro e testato per impostare le fasi iniziali del processo, garantendo che la complessa ingegneria dello sviluppo dei farmaci parta su basi solide.