NISTmAb-Based Small-Scale RP-HPLC Screening for DAR Adjustment in Cysteine Antibody-Drug Conjugation

In de wereld van de moderne geneeskunde ontwerpen wetenschappers vaak medicijnen die werken als geleide raketten. Dit zijn zogeheten antilichaam-drug-conjugaten. Ze bestaan uit twee delen: een groot eiwit genaamd een antilichaam, dat getraind is om specifieke kankercellen te vinden en eraan te plakken, en een piepklein, krachtig gif genaamd een drug-payload, dat de cel doodt zodra het antilichaam het heeft afgeleverd. De uitdaging ligt in het leveringssysteem zelf. Als het antilichaam te weinig medicijnen meedraagt, werkt de behandeling mogelijk niet. Als het er te veel draagt, kan het medicijn loslaten voordat het het doel bereikt of te giftig worden voor de patiënt. Om deze medicijnen veilig te maken, moeten onderzoekers precies controleren hoeveel medicijnmoleculen aan elk antilichaam worden bevestigd. Dit aantal is een cruciale maatstaf voor de kwaliteit, maar het vinden van de juiste balans vereist zorgvuldige tests van hoe het antilichaam wordt voorbereid en hoe het medicijn wordt bevestigd.

Een team van onderzoekers bij Ajinomoto in Japan en de Verenigde Staten pakte onlangs het probleem aan van hoe men deze condities efficiënt kan testen. Ze gebruikten een speciaal, bekend antilichaam genaamd NISTmAb als surrogaat voor echte kankerbestrijdende medicijnen. Dit referentiemateriaal is als een standaard liniaal die laboratoria over de hele wereld kunnen gebruiken om te controleren of hun instrumenten correct werken. De wetenschappers wilden zien of ze dit standaard antilichaam konden gebruiken om snel het beste recept te bepalen voor het bevestigen van een specifiek type kankerdodende drug. Hun doel was om een eenvoudige, kleinschalige test te creëren die andere laboratoria kan helpen bij het opzetten van hun eigen processen voor het maken van deze complexe medicijnen, zonder dat zij grote hoeveelheden dure materialen nodig hebben.

Het proces dat zij bestudeerden, omvat een specifieke chemische truc. Antilichamen worden bij elkaar gehouden door sterke chemische bruggen genaamd disulfidebruggen. Om de drug te bevestigen, braken de onderzoekers eerst voorzichtig enkele van deze bruggen om kleine, open haken op het antilichaam te creëren. Ze gebruikten een chemische stof genaamd TCEP om dit breken te doen. Zodra de haken open waren, introduceerden ze de drug, die was bevestigd aan een connector die ontworpen is om op die haken te klikken. De onderzoekers behandelden het antilichaam met verschillende hoeveelheden van de brekende stof en de drug-connector om te zien hoeveel drugs er zouden blijven plakken. Ze testten ook hoe lang ze de brekende stof moesten laten werken voordat ze de drug toevoegden.

Om de resultaten te zien, gebruikten de wetenschappers een machine die moleculen scheidt op basis van hoe ze reageren met een vloeistof. Deze machine, bekend als een reverse-phase high-performance liquid chromatograaf, werkt als een zeef die de antilichamen sorteert op basis van hoeveel drugs ze dragen. Antilichamen met meer drugs blijven anders aan de zeef plakken dan die met minder drugs, waardoor de onderzoekers ze kunnen tellen. Ze maten niet het exacte gewicht van de drugs of het biologische effect op cellen, maar ze konden het gemiddelde aantal drugs dat aan elk antilichaam is bevestigd schatten op basis van deze screeningsobservaties.

Het team kwam tot de conclusie dat de hoeveelheid van de brekende stof, TCEP, de belangrijkste factor was. Naarmate ze de hoeveelheid TCEP verhoogden, steeg het aantal bevestigde drugs in een gestage, voorspelbare lijn. Deze relatie bleef standhouden, zelfs wanneer ze de concentratie van het antilichaam in de oplossing veranderden. Ze ontdekten dat het gebruik van ongeveer 2,75 keer de hoeveelheid TCEP ten opzichte van het antilichaam consequent een gemiddelde van ongeveer vier drugs per antilichaam produceerde. Dit was een belangrijk bevinding omdat het aantoonde dat een enkele variabele kon worden gebruikt om het eindresultaat af te stemmen.

Vervolgens keken ze naar de hoeveelheid drug-connector die toegevoegd moest worden. Ze ontdekten dat zodra ze genoeg connector toevoegden om overeen te komen met het aantal open haken dat door de TCEP was gecreëerd, het toevoegen van nog meer connector het aantal bevestigde drugs niet meer verhoogde. Het systeem bereikte een punt van verzadiging waarbij het antilichaam simpelweg niet meer kon vasthouden. Dit vertelde hen dat er een limiet is aan hoeveel drugs kunnen worden bevestigd op basis van het aantal geopende haken, en dat het toevoegen van overtollige connector niet nodig is.

Ten slotte testten ze hoe lang de brekende stof moest werken. Het aantal bevestigde drugs steeg snel in de eerste 30 minuten en vlakte daarna af. Na 45 minuten was het proces essentieel voltooid, en langer wachten veranderde het resultaat niet. Hierdoor konden ze een handige tijdspanne van 45 minuten selecteren voor de reactie, wat het proces sneller en gemakkelijker te beheren maakte.

Door deze bevindingen te combineren, stelden de onderzoekers een specifieke set condities vast die betrouwbaar een antilichaam produceerde dat gemiddeld vier drugs draagt. Ze gebruikten een antilichaamconcentratie van 7,5 milligram per milliliter, voegden 2,75 keer de hoeveelheid TCEP toe, lieten het 45 minuten reageren en voegden vervolgens 7,5 keer de hoeveelheid drug-connector toe. Deze combinatie leverde een consistent resultaat op dat andere laboratoria als startpunt konden gebruiken.

De waarde van dit werk ligt niet in het creëren van een nieuw medicijn voor patiënten, maar in het bieden van een betrouwbare benchmark voor de laboratoria die dat wel doen. Door een algemeen bekend, goed gekarakteriseerd antilichaam te gebruiken, kunnen verschillende laboratoria nu hun methoden vergelijken en ervoor zorgen dat ze allemaal deze medicijnen op dezelfde manier meten en maken. De studie bevestigt dat deze kleinschalige screeningsmethode goed werkt voor het aanpassen van de drug-load, en biedt een praktisch hulpmiddel voor wetenschappers die nieuwe antilichaambehandelingen ontwikkelen. Het biedt een duidelijk, getest pad voor het opzetten van de eerste stappen van het proces, waardoor wordt gewaarborgd dat de complexe machinerie van de medicijnontwikkeling op een solide basis begint.