A water-soluble poly(diphenylacetylene)-based photoredox system for visible-light-driven DNA fragmentation

आणविक जीव विज्ञान (molecular biology) की प्रयोगशालाओं में, डीएनए को काटने की क्षमता एक मौलिक उपकरण है। वैज्ञानिकों को अक्सर आनुवंशिक सामग्री के लंबे, मुड़े हुए धागों को तोड़ने की आवश्यकता होती है ताकि वे यह अध्ययन कर सकें कि जीन कैसे व्यवस्थित होते हैं, गुणसूत्र (chromosomes) कैसे पैक होते हैं, या कोशिकाएं स्वयं की मरम्मत कैसे करती हैं। पारंपरिक रूप से, इस कटाई को मुख्य रूप से दो तरीकों से किया जाता रहा है। पहला तरीका प्राकृतिक एंजाइमों का उपयोग करता है, जो आणविक कैंची की तरह कार्य करते हैं और केवल आनुवंशिक कोड के बहुत विशिष्ट, पूर्व-निर्धारित अनुक्रमों पर ही काटते हैं। दूसरा तरीका भौतिक है, जिसमें ध्वनि तरंगों या यांत्रिक बल का उपयोग करके डीएनए को यादृच्छिक टुकड़ों में तोड़ दिया जाता है। हालांकि ये विधियां अच्छी तरह से काम करती हैं, लेकिन इनमें एक महत्वपूर्ण विशेषता की कमी है: एक सटीक क्षण और एक विशिष्ट स्थान पर इन्हें चालू और बंद करने की क्षमता। एंजाइम जोड़े जाने के बाद लगातार काम करते रहते हैं, और भौतिक बल को उसके पड़ोसियों को नुकसान पहुँचाए बिना एक एकल कोशिका पर लागू करना कठिन है। प्रकाश एक समाधान प्रदान करता है। क्योंकि प्रकाश को तुरंत चालू किया जा सकता है और एक बहुत छोटे बिंदु पर केंद्रित किया जा सकता है, यह समय और स्थान दोनों में उच्च सटीकता के साथ रासायनिक प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित करने का एक तरीका प्रदान करता है, बशर्ते कि प्रतिक्रिया हानिकारक पराबैंगनी (ultraviolet) किरणों के बजाय दृश्य प्रकाश द्वारा ट्रिगर की जा सके।

कनाज़ावा विश्वविद्यालय और जापान के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एडवांस्ड इंडस्ट्रियल साइंस एंड टेक्नोलॉजी के शोधकर्ताओं की एक टीम ने एक नई प्रणाली विकसित की है जो बिना किसी विशिष्ट अनुक्रम को लक्षित किए, दृश्य प्रकाश का उपयोग करके डीएनए को काटती है। उन्होंने एक जल-घुलनशील बहुलक (polymer) बनाया है, जो अणुओं की एक लंबी श्रृंखला है जो चीनी की तरह पानी में घुल सकती है, और नीली रोशनी के संपर्क में आने पर एक उत्प्रेरक (catalyst) के रूप में कार्य करती है। यह बहुलक 'पॉली(डाइफेनिलएसिटिलीन)' नामक संरचना पर आधारित है, जिसका बैकबोन प्रकाश को अवशोषित करने और ऊर्जा को उसकी लंबाई के साथ आगे बढ़ाने में सक्षम है। इस बैकबोन को जैविक वातावरण में काम करने योग्य बनाने के लिए, शोधकर्ताओं ने इसमें एथिलीन ग्लाइकोल से बनी साइड चेन जोड़ी है, जो इस बहुलक को पानी के अनुकूल बनाती है। जब इस बहुलक को एक विशिष्ट प्रकार के रसायन जिसे अमीन डोनर (amine donor) कहा जाता है, के साथ मिलाया जाता है और 425 नैनोमीटर की तरंग दैर्ध्य वाली नीली रोशनी के संपर्क में लाया जाता है, तो यह एक ऐसी प्रतिक्रिया को ट्रिगर करता है जो डीएनए के धागों को तोड़ देती है। इस प्रक्रिया के लिए बहुलक को किसी विशिष्ट आनुवंशिक कोड को पहचानने की आवश्यकता नहीं होती है; इसके बजाय, यह एक सामान्य कटर के रूप में कार्य करता है जिसे केवल प्रकाश चमकाकर सक्रिय किया जा सकता है।

शोधकर्ताओं ने पहले इस प्रणाली का परीक्षण प्लाज्मिड डीएनए (plasmid DNA) का उपयोग करके किया, जो आनुवंशिक सामग्री के छोटे, गोलाकार लूप होते हैं जिन्हें अक्सर लैब में मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। उन्होंने मिश्रण में बहुलक और तीन अलग-अलग अमीन डोनरों में से एक के साथ प्लाज्मिड डीएनए रखा, और फिर मिश्रण पर नीली रोशनी डाली। यह देखने के लिए कि क्या डीएनए को काटा गया था, उन्होंने मिश्रण को एक जेल के माध्यम से चलाया, जो डीएनए के टुकड़ों को उनके आकार के आधार पर अलग करता है। नियंत्रण प्रयोगों (control experiments) में, जहाँ प्रकाश बंद था या बहुलक गायब था, डीएनए बरकरार रहा और अपने मूल, तंग लूप्स में जेल के माध्यम से चला। हालांकि, जब नीली रोशनी और बहुलक दोनों की उपस्थिति में लाइट चालू की गई, तो पैटर्न नाटकीय रूप से बदल गया। तंग लूप गायब हो गए, और उनकी जगह छोटे टुकड़ों के एक बिखराव (smear) ने ले ली, जो यह दर्शाता कि डीएनए को टुकड़ों में काट दिया गया है। शोधकर्ताओं ने पुष्टि की कि इस कटाई के लिए तीनों घटक—बहुलक, अमीन डोनर और प्रकाश—आवश्यक थे। प्रकाश के बिना, प्रतिक्रिया शुरू नहीं हुई, जिससे सिद्ध हुआ कि फोटॉन से प्राप्त ऊर्जा ही इस प्रक्रिया को अनलॉक करने की कुंजी थी।

यह समझने के लिए कि कौन से रासायनिक घटक सबसे अच्छा काम करते हैं, टीम ने तीन अलग-अलग अमीन डोनरों की तुलना की। एक मानक रसायन था, दूसरा उस रसायन का एक संस्करण था जिसमें पानी के अनुकूल बनाने के लिए एक अल्कोहल समूह जोड़ा गया था, और तीसरा दो अमीन समूहों वाला एक बड़ा अणु था। प्लाज्मिड डीएनए के साथ टेस्ट ट्यूब प्रयोगों में, तीनों डोनर काम कर गए, लेकिन बड़े, डबल-अमीन अणु ने सबसे व्यापक कटाई की। हालांकि, शोधकर्ताओं ने देखा कि अणु का आकार और आकृति मायने रखती है। उन्होंने आगे के परीक्षण के लिए अल्कोहल-फंक्शनलाइज्ड डोनर को चुना क्योंकि यह पानी के साथ अनुकूलता और अपेक्षाकृत सरल संरचना के बीच संतुलन बनाता है, जिससे इसे जैविक सेटिंग्स में उपयोग करना आसान हो जाता है। उन्होंने यह भी पाया कि डोनर की मात्रा मायने रखती है; जब उन्होंने घोल में डोनर की सांद्रता बढ़ाई, तो डीएनए की कटाई अधिक गंभीर हो गई। इससे पता चला कि यह प्रतिक्रिया इन अणुओं की एक निरंतर आपूर्ति पर निर्भर करती है ताकि कटाई की प्रक्रिया को जारी रखा जा सके।

इस प्रणाली की असली परीक्षा तब हुई जब शोधकर्ता टेस्ट ट्यूब से जीवित कोशिकाओं की ओर बढ़े। उन्होंने मानव कोशिकाओं, जिन्हें HEK293A के रूप में जाना जाता है, को बहुलक और अमीन डोनरों के साथ उपचारित किया, फिर कोशिकाओं को नीली रोशनी के संपर्क में लाया। इसके बाद, उन्होंने कोशिका के केंद्रक (nucleus) के भीतर मौजूद मुख्य आनुवंशिक सामग्री यानी जीनोमिक डीएनए को निकाला और उसका विश्लेषण किया। परिणामों ने दिखाया कि यह प्रणाली जीवित कोशिकाओं के भीतर डीएनए को वास्तव में खंडित कर सकती है। उच्च-आणविक-भार वाला डीएनए, जो आमतौर पर जेल के शीर्ष पर एक ठोस बैंड के रूप में दिखाई देता है, छोटे टुकड़ों में टूट गया जो जेल में फैल गए। दिलचस्प बात यह है कि विभिन्न डोनरों का प्रदर्शन इस वातावरण में बदल गया। जबकि बड़ा, डबल-अमीन डोनर टेस्ट ट्यूब में सबसे शक्तिशाली था, इसने कोशिकाओं में खराब प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, अल्कोहल-फंक्शनलाइज्ड डोनर, जो टेस्ट ट्यूब में एक ठोस प्रदर्शन करने वाला था, कोशिकीय डीएनए को काटने में सबसे प्रभावी साबित हुआ, और यह इस बात पर निर्भर था कि प्रकाश कितनी देर तक डाला गया। यह अंतर बताता है कि कोशिका के भीतर का जटिल वातावरण, जिसमें कई अन्य अणु और बाधाएं होती हैं, इन रसायनों की परस्पर क्रिया को बदल देता है।

शोधकर्ता प्रस्तावित करते हैं कि कटाई इलेक्ट्रॉनों के स्थानांतरण के साथ शुरू होती है। जब नीली रोशनी बहुलक से टकराती है, तो यह बहुलक के बैकबोन में इलेक्ट्रॉनों को उत्तेजित करती है। अमीन डोनर फिर उत्तेजित बहुलक को एक इलेक्ट्रॉन देता है, जिससे एक आवेशित अवस्था (charged state) उत्पन्न होती है जो अस्थिर और प्रतिक्रियाशील होती है। यही प्रतिक्रियाशील अवस्था अंततः डीएनए के धागों को तोड़ने का कारण बनती है। हालांकि, वह विशिष्ट रासायनिक प्रजाति जो वास्तव में डीएनए को काटती है, अभी भी एक रहस्य बनी हुई है। यह डीएनए में इलेक्ट्रॉन का सीधा स्थानांतरण हो सकता है, या इसमें हवा में ऑक्सीजन के साथ माध्यमिक प्रतिक्रियाएं शामिल हो सकती हैं जो काटने में सक्षम प्रतिक्रियाशील प्रजातियां बनाती हैं। अध्ययन अभी तक यह पुष्टि नहीं करता है कि इनमें से कौन सा मार्ग प्राथमिक है, और न ही यह सटीक रूप से बताता है कि कोशिका के भीतर कटाई कहाँ होती है। यह संभव है कि प्रतिक्रिया कोशिका के अंदर होती है, या यह कोशिका को निकालने की प्रक्रिया के दौरान होने के बाद भी हो सकती है।

इन अनसुलझे प्रश्नों के बावजूद, यह कार्य प्रकाश के साथ डीएनए को नियंत्रित करने के लिए एक नया मंच स्थापित करता है। जल-घुलनशील बहुलक एक बहुमुखी उपकरण के रूप में कार्य करता है जिसे इसकी साइड चेन बदलकर ट्यून किया जा सकता है। शोधकर्ता नोट करते हैं कि भविष्य में, वे बहुलक को विशिष्ट लक्ष्य समूहों (targeting groups) के साथ जोड़ सकते हैं ताकि इसे कोशिका के विशिष्ट भागों या ऊतकों के विशिष्ट प्रकारों तक निर्देशित किया जा सके। यह आनुवंशिक सामग्री के और भी सटीक हेरफेर की अनुमति देगा। फिलहाल, यह प्रणाली एक महत्वपूर्ण कदम है, जो सरल टेस्ट ट्यूब प्रतिक्रियाओं से जटिल कोशिकीय वातावरण की ओर बढ़ती है। यह प्रदर्शित करता है कि दृश्य प्रकाश का उपयोग एंजाइमों या विशिष्ट आनुवंशिक अनुक्रमों की आवश्यकता के बिना डीएनए के विखंडन को ट्रिगर करने के लिए किया जा सकता है, जो समय और स्थान के उच्च नियंत्रण के साथ जीवन की यांत्रिकी का अध्ययन करने का एक नया तरीका प्रदान करता है। निष्कर्ष बताते हैं कि रासायनिक भागीदारों और प्रकाश एक्सपोजर को समायोजित करके, वैज्ञानिक इस प्रक्रिया को विभिन्न जैविक जांचों के लिए सूक्ष्म रूप से नियंत्रित (fine-tune) कर सकते हैं, जिससे उन प्रयोगों के लिए एक द्वार खुलता है जो पहले कठिन थे।