A water-soluble poly(diphenylacetylene)-based photoredox system for visible-light-driven DNA fragmentation

Nei laboratori di biologia molecolare, la capacità di tagliare il DNA è uno strumento fondamentale. Gli scienziati hanno spesso bisogno di rompere i lunghi filamenti intrecciati di materiale genetico per studiare come i geni sono organizzati, come i cromosomi sono impacchettati o come le cellule si riparano. Tradizionalmente, questo taglio è stato eseguito in due modi principali. Il primo prevede l'uso di enzimi naturali, che agiscono come forbici molecolari che tagliano solo in sequenze specifiche e predeterminate di lettere nel codice genetico. Il secondo metodo è fisico, utilizzando onde sonore o forza meccanica per frantumare il DNA in pezzi casuali. Sebbene questi metodi funzionino bene, mancano di una caratteristica cruciale: la capacità di essere accesi e spenti in un momento preciso e in un luogo specifico. Gli enzimi lavorano continuamente una volta aggiunti, e la forza fisica è difficile da applicare a una singola cellula senza danneggiare le sue vicine. La luce offre una soluzione. Poiché la luce può essere accesa istantaneamente e focalizzata su un minuscolo punto, fornisce un modo per controllare le reazioni chimiche con alta precisiono sia nel tempo che nello spazio, a condizione che la reazione possa essere innescata dalla luce visibile piuttosto che da raggi ultravioletti dannosi.

Un team di ricercatori della Università di Kanazawa e dell'Istituto Nazionale di Scienza e Tecnologia Industriale Avanzata in Giappone ha sviluppato un nuovo sistema che utilizza la luce visibile per tagliare il DNA senza la necessità di una sequenza specifica da colpire. Hanno creato un polimero solubile in acqua, una lunga catena di molecole che può sciogliersi in acqua come lo zucchero, che agisce come catalizzatore quando esposto alla luce blu. Questo polimero si basa su una struttura chiamata poli(difenilacetilene), che possiede uno scheletro capace di assorbire la luce e trasmettere l'energia lungo la sua lunghezza. Per far sì che questo scheletro funzioni in un ambiente biologico, i ricercatori hanno attaccato catene laterali fatte di glicole etilenico, una sostanza che rende il polimero amichevole verso l'acqua. Quando questo polimero viene miscelato con un tipo specifico di sostanza chimica chiamata donatore di ammina ed esposto alla luce blu con una lunghezza d'onda di 425 nanometri, innesca una reazione che rompe i filamenti di DNA. Il processo non richiede che il polimero riconosca un codice genetico specifico; invece, agisce come un tagliatore generale che può essere attivato semplicemente facendo incidere la luce.

I ricercatori hanno prima testato questo sistema utilizzando il DNA plasmidico, che sono piccoli anelli circolari di materiale genetico spesso usati come modelli in laboratorio. Hanno posto il DNA plasmidico in una soluzione contenente il polimero e uno di tre diversi donatori di ammina, poi hanno irradiato la miscela con la luce blu. Per vedere se il DNA era stato tagliato, hanno fatto passare la miscela attraverso un gel, un processo che separa i frammenti di DNA in base alla dimensione. Negli esperimenti di controllo, dove la luce era spenta o il polimero era assente, il DNA rimaneva intatto e si muoveva attraverso il gel nei suoi anelli stretti originali. Tuttavia, quando la luce era accesa in presenza sia del polimero che del donatore di ammina, il pattern cambiava drasticamente. I loop stretti scomparivano, sostituiti da una scia di frammenti più piccoli, indicando che il DNA era stato affettato in pezzi. I ricercatori hanno confermato che tutti e tre i componenti — il polimero, il donatore di ammina e la luce — erano necessari affinché questo taglio avvenisse. Senza la luce, la reazione non partiva, provando che l'energia dei fotoni era la chiave per sbloccare il processo.

Per capire quali ingredienti chimici funzionassero meglio, il team ha confrontato tre diversi donatori di ammina. Uno era una sostanza chimica standard, un altro era una versione di quella sostanza con un gruppo alcolico aggiunto per renderla più amichevole verso l'acqua, e il terzo era una molecola più grande con due gruppi amminici. Negli esperimenti in provetta con il DNA plasmidico, tutti e tre i donatori hanno funzionato, ma la molecola più grande, con il doppio gruppo amminico, ha prodotto il taglio più esteso. Tuttavia, i ricercatori hanno notato che la dimensione e la forma della molecola contavano. Hanno scelto il donatore funzionalizzato con l'alcol per ulteriori test perché bilanciava la compatibilità con l'acqua con una struttura relativamente semplice, rendendolo più facile da gestire in contesti biologici. Hanno anche scoperto che la quantità di donatore utilizzata importava; quando hanno aumentato la concentrazione del donatore nella soluzione, il taglio del DNA diventava più severo. Ciò suggeriva che la reazione dipendeva da un approvvigionamento costante di queste molecole per mantenere in corso il processo di taglio.

La vera prova del sistema è arrivata quando i ricercatori si sono spostati dalle provette alle cellule viventi. Hanno trattato cellule umane, note come HEK293A, con il polimero e i donatori di ammina, poi hanno esposto le cellule alla luce blu. Successivamente, hanno estratto il DNA genomico — il materiale genetico principale all'interno del nucleo cellulare — e lo hanno analizzato. I risultati hanno mostrato che il sistema poteva effettivamente frammentare il DNA all'interno delle cellule viventi. Il DNA ad alto peso molecolare, che normalmente appare come una banda solida in cima al gel, si è scomposto in pezzi più piccoli che si sono diffusi attraverso il gel. Interessantemente, le prestazioni dei diversi donatori sono cambiate in questo ambiente. Mentre il donatore a doppia ammina, il più potente in provetta, ha fornito scarse prestazioni nelle cellule, il donatore funzionalizzato con l'alcol, che era stato un solido esecutore nella provetta, è diventato il più efficace nel tagliare il DNA cellulare in un modo che dipendeva da quanto tempo la luce veniva irradiata. Questa differenza suggerisce che l'ambiente complesso all'interno di una cella, con le sue molte altre molecole e barriere, cambia il modo in cui queste sostanze chimiche interagiscono.

I ricercatori propongono che il taglio inizi con un trasferimento di elettroni. Quando la luce blu colpisce il polimero, eccita gli elettroni nello scheletro del polimero. Il donatore di ammina cede quindi un elettrone a questo polimero eccitato, creando uno stato carico che è instabile e reattivo. Questo stato reattivo è ciò che alla fine porta alla rottura dei filamenti di DNA. Tuttavia, l'identità esatta della specifica specie chimica che effettua l'incisione del DNA rimane un mistero. Potrebbe trattarsi di un trasferimento diretto di un elettrone al DNA, oppure potrebbe comportare reazioni secondarie con l'ossigeno nell'aria che creano specie reattive capaci di tagliare. Lo studio non conferma ancora quale di questi percorsi sia quello primario, né individua esattamente dove all'interno della cellula avvenga il taglio. È possibile che la reazione avvenga all'interno della cellula, o potrebbe verificarsi dopo che la cellula è stata aperta durante il processo di estrazione.

Nonostante queste domande rimaste in sospeso, il lavoro stabilisce una nuova piattaforma per controllare il DNA con la luce. Il polimero solubile in acqua agisce come uno strumento versatile che può essere tarato cambiando le sue catene laterali. I ricercatori osservano che in futuro potrebbero attaccare gruppi di targeting specifici al polimero per guidarlo verso parti particolari di una cellula o verso tipi specifici di tessuto. Ciò permetterebbe una manipolazione del materiale genetico ancora più precisa. Per ora, il sistema rappresenta un passo avanti significativo, passando da semplici reazioni in provetta a complessi ambienti cellulari. Dimostra che la luce visibile può essere utilizzata per innescare la frammentazione del DNA senza la necessità di enzimi o sequenze genetiche specifiche, offrendo un nuovo modo per studiare la meccanica della vita con un alto grado di controllo temporale e spaziale. Le scoperte suggeriscono che, regolando i partner chimici e l'esposizione alla luce, gli scienziati possono perfezionare questo processo per varie investigazioni biologiche, aprendo la porta a esperimenti che prima erano difficili da eseguire.