A water-soluble poly(diphenylacetylene)-based photoredox system for visible-light-driven DNA fragmentation

In den Laboratorien der Molekularbiologie ist die Fähigkeit, DNA zu schneiden, ein grundlegendes Werkzeug. Wissenschaftler müssen oft die langen, verdrehten Stränge des genetischen Materials aufbrechen, um zu untersuchen, wie Gene organisiert sind, wie Chromosomen verpackt sind oder wie Zellen sich selbst reparieren. Traditionell wurde dieser Schnitt auf zwei Hauptarten durchgeführt. Die erste Methode nutzt natürliche Enzyme, die wie molekulare Scheren wirken und nur an sehr spezifischen, vorbestimmten Buchstabenfolgen im genetischen Code schneiden. Die zweite Methode ist physikalisch und nutzt Schallwellen oder mechanische Kraft, um die DNA in zufällige Stücke zu zertrümmern. Während diese Methoden gut funktionieren, fehlt ihnen ein entscheidendes Merkmal: die Fähigkeit, zu einem präzisen Zeitpunkt und an einem spezifischen Ort ein- und ausgeschaltet zu werden. Enzyme arbeiten kontinuierlich, sobald sie hinzugefügt wurden, und physikalische Kraft ist schwierig auf eine einzelne Zelle anzuwenden, ohne deren Nachbarzellen zu beschädigen. Licht bietet eine Lösung. Da Licht sofort eingeschaltet und auf einen winzigen Punkt fokussiert werden kann, bietet es eine Möglichkeit, chemische Reaktionen mit hoher Präzision in Zeit und Raum zu steuern, vorausgesetzt, die Reaktion kann durch sichtbares Licht statt durch schädliche ultraviolette Strahlen ausgelöst werden.

Ein Forschungsteam der Kanazawa University und des National Institute of Advanced Industrial Science and Technology in Japan hat ein neues System entwickelt, das sichtbares Licht verwendet, um DNA zu schneiden, ohne eine spezifische Sequenz als Ziel zu benötigen. Sie entwickelten ein wasserlösliches Polymer, eine lange Kette von Molekülen, die sich wie Zucker in Wasser auflösen kann, welches als Katalysator wirkt, wenn es blauem Licht ausgesetzt wird. Dieses Polymer basiert auf einer Struktur namens Poly(diphenylacetylen), die ein Rückgrat besitzt, das in der Lage ist, Licht zu absorbieren und Energie entlang seiner Länge weiterzugeben. Um dieses Rückgrats in einer biologischen Umgebung funktionsfähig zu machen, fügten die Forscher Seitenketten aus Ethylenglykol an, eine Substanz, die das Polymer wasserfreundlich macht. Wenn dieses Polymer mit einer bestimmten Art von chemischem Stoff, einem Amindonor, gemischt und blauem Licht mit einer Wellenlänge von 425 Nanometern ausgesetzt wird, löst es eine Reaktion aus, die die DNA-Stränge aufbricht. Der Prozess erfordert nicht, dass das Polymer einen spezifischen genetischen Code erkennt; stattdessen fungiert es als allgemeiner Schneider, der einfach durch das Anstrahlen aktiviert werden kann.

Die Forscher testeten dieses System zuerst mit Plasmid-DNA, bei der es sich um kleine, kreisförmige Loops aus genetischem Material handelt, die häufig als Modelle im Labor verwendet werden. Sie gaben die Plasmid-DNA in eine Lösung enthaltend das Polymer und einen von drei verschiedenen Amindonoren, und bestrahlten die Mischung dann mit dem blauen Licht. Um zu sehen, ob die DNA geschnitten worden war, führten sie die Mischung durch ein Gel, einen Prozess, der DNA-Fragmente nach Größe trennt. In den Kontrollversuchen, bei denen das Licht ausgeschaltet oder das Polymer fehlend war, blieb die DNA intakt und bewegte sich in ihren ursprünglichen, engen Loops durch das Gel. Als jedoch das Licht in Gegenwart sowohl des Polymers als auch des Amindonors eingeschaltet wurde, änderte sich das Muster dramatisch. Die engen Loops verschwanden und wurden durch ein Verschmieren kleinerer Fragmente ersetzt, was darauf hindeutete, dass die DNA in Stücke geschnitten worden war. Die Forscher bestätigten, dass alle drei Komponenten – das Polymer, der Amindonor und das Licht – notwendig waren, damit dieser Schnitt geschah. Ohne das Licht startete die Reaktion nicht, was bewies, dass die Energie der Photonen der Schlüssel zur Freisetzung des Prozesses war.

Um zu verstehen, welche chemischen Zutaten am besten funktionierten, verglich das Team drei verschiedene Amindonoren. Einer war ein Standardchemikalie, ein weiterer war eine Version dieser Chemikalie mit einer hinzugefügten Alkoholgruppe, um sie wasserfreundlicher zu machen, und der dritte war ein größeres Molekül mit zwei Amingruppen. In den Teströhrchen-Experimenten mit Plasmid-DNA funktionierten alle drei Donoren, aber das größere, doppelt-amin-haltige Molekül erzeugte den umfangreichsten Schnitt. Dennoch bemerkten die Forscher, dass die Größe und Form des Moleküls eine Rolle spielten. Sie entschieden sich für den alkohol-funktionalisierten Donor für weitere Tests, da dieser die Wasserverträglichkeit mit einer relativ einfachen Struktur ausbalancierte, was die Arbeit in biologischen Umgebungen erleichterte. Sie fanden auch heraus, dass die Menge des verwendeten Donors entscheidend war; wenn sie die Konzentration des Donors in der Lösung erhöhten, wurde der DNA-Schnitt schwerwiegender. Dies deutet darauf hin, dass die Reaktion auf eine stetige Versorgung mit diesen Molekülen angewiesen war, um den Schneideprozess aufrechtzuerhalten.

Der wahre Test des Systems kam, als die Forscher vom Teströhrchen zu lebenden Zellen übergingen. Sie behandelten menschliche Zellen, bekannt als HEK293A, mit dem Polymer und den Amindonoren und setzten die Zellen dann dem blauen Licht aus. Danach extrahierten sie die genomische DNA – das Hauptgenmaterial im Zellkern der Zelle – und analysierten sie. Die Ergebnisse zeigten, dass das System in der Lage war, die DNA innerhalb lebender Zellen zu fragmentieren. Die hochmolekulare DNA, die normalerweise als solide Bande am oberen Rand des Gels erscheint, brach in kleinere Stücke auf, die sich über das Gel verteilten. Interessanterweise änderte sich die Leistung der verschiedenen Donoren in dieser Umgebung. Während der große, doppelt-amin-haltige Donor im Teströhrchen am leistungsstärksten war, schnitt er in den Zellen schlecht ab. Im Gegensatz dazu war der alkohol-funktionalisierte Donor, der in der Teströhrchen-Versuchsanordnung ein solider Performer gewesen war, am effektivsten beim Schneiden der zellulären DNA, wobei die Wirkung davon abhing, wie lange das Licht angestrahlt wurde. Dieser Unterschied legt nahe, dass die komplexe Umgebung innerhalb einer Zelle, mit ihren vielen anderen Molekülen und Barrieren, die Art und Weise verändert, wie diese Chemikalien interagieren.

Die Forscher schlagen vor, dass der Schnitt mit einem Elektronentransfer beginnt. Wenn das blaue Licht auf das Polymer trifft, regt es die Elektronen im Rückgrat des Polymers an. Der Amindonor gibt dann ein Elektron an dieses angeregte Polymer ab, wodurch ein geladener Zustand entsteht, der instabil und reaktiv ist. Dieser reaktive Zustand ist das, was schließlich zum Aufbrechen der DNA-Stränge führt. Die genaue Identität der spezifischen chemischen Spezies, die die DNA tatsächlich zerschneidet, bleibt jedoch ein Rätsel. Es könnte sich um einen direkten Elektronentransfer auf die DNA handeln, oder es könnte eine sekundäre Reaktion mit dem Sauerstoff in der Luft beinhalten, die reaktive Spezies erzeugt, die in der Lage sind zu schneiden. Die Studie bestätigt noch nicht, welcher dieser Pfade der primäre ist, noch lokalisiert sie genau, wo innerhalb der Zelle der Schnitt erfolgt. Es ist möglich, dass die Reaktion innerhalb der Zelle stattfindet, oder sie könnte nach dem Aufbrechen der Zelle während des Extraktionsprozesses erfolgen.

Trotz dieser unbeantworteten Fragen etabliert die Arbeit eine neue Plattform für die Steuerung von DNA mit Licht. Das wasserlösliche Polymer fungiert als vielseitiges Werkzeug, das durch Veränderung seiner Seitenketten angepasst werden kann. Die Forscher merken an, dass sie in Zukunft spezifische Targeting-Gruppen an das Polymer anbinden könnten, um es zu bestimmten Teilen einer Zelle oder zu bestimmten Arten von Gewebe zu leiten. Dies würde eine noch präzisere Manipulation des genetischen Materials ermöglichen. Für den Moment stellt das System einen bedeutenden Schritt nach vorn dar, indem es von einfachen Teströhrchen-Reaktionen zu komplexen zellulären Umgebungen übergeht. Es demonstriert, dass sichtbares Licht verwendet werden kann, um die Fragmentierung der DNA ohne die Notwendigkeit von Enzymen oder spezifischen genetischen Sequenzen auszulösen, was einen neuen Weg eröffnet, die Mechanik des Lebens mit einem hohen Maß an zeitlicher und räumlicher Kontrolle zu untersuchen. Die Ergebnisse legen nahe, dass Wissenschaftler durch Anpassung der chemischen Partner und der Lichtexposition diesen Prozess für verschiedene biologische Untersuchungen feinabstimmen können, was die Tür zu Experimenten öffnet, die zuvor schwer durchführbar waren.