Cas9 nickase-mediated gene editing enables precise large-fragment integration with minimal byproducts

जीवित कोशिकाओं के भीतर आनुवंशिक कोड को फिर से लिखने की क्षमता ने जीव विज्ञान को बदल दिया है, जिससे उन बीमारियों को ठीक करने की उम्मीद जगी है जिन्हें कभी अछूत माना जाता था। इस क्रांति के केंद्र में ऐसे उपकरण हैं जो आणविक कैंची (molecular scissors) की तरह काम करते हैं, जो डीएनए को विशिष्ट स्थानों पर काटते हैं ताकि कोशिका की प्राकृतिक मरम्मत प्रणाली को एक टूटे हुए जीन को ठीक करने या एक नया जीन डालने के लिए निर्देशित किया जा सके। वर्षों तक, सबसे आम विधि डीएनए हेलिक्स में एक पूर्ण, दो-तंतु वाला (double-stranded) विच्छेद करने पर निर्भर थी। प्रभावी होने के बावजूद, यह दृष्टिकोण अक्सर कोशिका को घबराहट में डाल देता है और वह घाव को एक अव्यवस्थित तरीके से भरने की कोशिश करती है, जिससे अनचाहे उत्परिवर्तन (mutations) या आस-पास के हिस्सों में अवांछित परिवर्तन हो जाते हैं। अन्य नई विधियों ने पूरी तरह से कट लगाने से बचने की कोशिश की है, जिसमें नए सूचनाओं को सीधे लिखने के लिए अधिक सूक्ष्म उपकरणों का उपयोग किया जाता है, लेकिन जब कार्य के लिए बड़े आनुवंशिक खंडों को डालने की आवश्यकता होती है, तो वे अक्सर संघर्ष करती हैं। चुनौती एक ऐसा तरीका खोजने की थी जिससे बिना किसी आकस्मिक क्षति के या कोशिका की विकास की विशिष्ट अवस्था की आवश्यकता के बिना, बड़ी मात्रा में नया डीएनए सटीक रूप से स्थापित किया जा सके।

त्सिंहहुआ विश्वविद्यालय के शोधकर्ताओं की एक टीम ने एक नया दृष्टिकोण विकसित किया है जो इन पुरानी सीमाओं को दरकिनार करता है। डीएनए स्ट्रैंड को पूरी तरह से दो भागों में काटने के बजाय, वे आणविक कैंची के एक संशोधित संस्करण का उपयोग करते हैं जो डीएनए हेलिक्स के विपरीत स्ट्रैंड्स पर दो छोटे, एक-तरफा निशान (nicks) बनाता है। एक ज़िप की कल्पना करें जहाँ ज़िप के दांत एक तरफ थोड़े अलग हैं और फिर दूसरी तरफ भी, जिससे मुख्य संरचना को तोड़े बिना एक छोटा, स्थानीय अंतराल बन जाता है। यह तकनीक, जिसे शोधकर्ताओं ने NKGE कहा है, एक संक्षिप्त खिड़की बनाती है जहाँ कोशिका की मरम्मत प्रणाली डोनर डीएनए के एक टुकड़े को पकड़कर उसे सही स्थान पर खिसका सकती है। क्योंकि डीएनए कभी भी पूरी तरह से नहीं कटता, इसलिए कोशिका आपातकालीन मरम्मत पथों (emergency repair pathways) को सक्रिय नहीं करती है जो आमतौर पर त्रुटियों का कारण बनते हैं। परिणाम एक ऐसी प्रणाली है जो उल्लेखनीय सटीकता के साथ आनुवंशिक सामग्री के बड़े टुकड़ों को डाल सकती है, जिससे लगभग कोई अवांछित उपोत्पाद (byproducts) नहीं बचते।

शोधकर्ताओं ने इस विधि का परीक्षण एक परिष्कृत रिपोर्टिंग प्रणाली का उपयोग करके किया, जिसे यह दिखाने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि कोशिका के भीतर वास्तव में क्या होता है। उन्होंने एक ऐसी व्यवस्था बनाई जहाँ एक सटीक प्रविष्टि (insertion) कोशिका को दो रंगों के फ्लोरोसेंस (fluorescence) से चमका देती है, जबकि कोई भी अव्यवस्थित, त्रुटि-पूर्ण मरम्मत केवल एक रंग को चमकाती है। दोनों छोटे निक्स (nicks) के बीच की दूरी को समायोजित करके, उन्होंने एक स्पष्ट पैटर्न खोजा: निक्स जितने दूर थे, त्रुटियां उतनी ही कम हुईं। महत्वपूर्ण रूप से, जब उन्होंने डाला जाने वाले डीएनए के एक डोनर टुकड़े को प्रदान किया, तो त्रुटियां और भी कम हो गईं, और सही, दो-रंग वाली प्रविष्टि प्रमुख परिणाम बन गई। इससे सिद्ध हुआ कि यह विधि कोशिका को गलतियाँ करने से सक्रिय रूप से रोकती है और वांछित मरम्मत की ओर निर्देशित करती है। उन्होंने पाया कि यह प्रणाली डोनर डीएनए की बहुत कम मात्रा के साथ भी कुशलतापूर्वक काम करती है, जिसमें पिछले तरीकों की तुलना में बहुत कम सामग्री की आवश्यकता होती है।

सबसे आश्चर्यजनक खोजों में से एक वह प्रकार का डीएनए टुकड़ा था जिसने सबसे अच्छा काम किया। शोधकर्ता शुरू में उम्मीद कर रहे थे कि डोनर डीएनए के पास एक विशिष्ट, टेढ़ा-मेढ़ा सिरा (jagged end) होना चाहिए ताकि वह निक किए गए स्थान में फिट हो सके, ठीक वैसे ही जैसे एक पहेली के टुकड़े को एक विशिष्ट आकार की आवश्यकता होती है। इसके बजाय, उन्होंने पाया कि साधारण, सीधे किनारों वाले डीएनए के टुकड़े और भी बेहतर काम करते हैं। कोशिका के अपने आंतरिक एंजाइम स्वतः ही इन सीधे सिरों को संसाधित करते हैं, जिससे उन्हें प्रविष्टि के लिए तैयार किया जाता है, और इसके लिए वैज्ञानिकों द्वारा किसी अतिरिक्त चरण की आवश्यकता नहीं होती। यह प्रक्रिया को काफी सरल बनाता है, जिससे कोशिका में पेश करने से पहले डीएनए के टुकड़ों की जटिल प्रयोगशाला तैयारी की आवश्यकता समाप्त हो जाती है।

इस नई विधि की वास्तविक शक्ति तब सामने आई जब टीम ने बड़े डीएनए खंडों को डालने की इसकी क्षमता का परीक्षण किया। पिछले प्रयासों में, कुछ सौ अक्षरों से बड़े आनुवंशिक सामग्री को डालना कठिन और अक्षम था। अपने नए दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, शोधकर्ताओं ने मानव कोशिकाओं में 10,000 अक्षरों तक लंबे डीएनए खंडों को सफलतापूर्वक डाला। उन्होंने इसे विभिन्न प्रकार की मानव कोशिकाओं में परखा, जिनमें वे कोशिकाएं भी शामिल थीं जो तेजी से विभाजित नहीं होती हैं, और पाया कि यह विधि सभी स्तरों पर लगातार काम करती है। कई मामलों में, इन बड़े टुकड़ों को डालने की दक्षता मौजूदा सर्वोत्तम विकल्पों से छह गुना से अधिक थी। इसके अलावा, जब उन्होंने जीनोम के अन्य हिस्सों में अनपेक्षित परिवर्तनों की तलाश की, तो उन्हें कोई नहीं मिला, जिससे पुष्टि हुई कि यह विधि अत्यधिक विशिष्ट और सुरक्षित है।

अध्ययन ने इस नई तकनीक की तुलना क्षेत्र के वर्तमान स्वर्ण मानकों (gold standards) से भी की, जिसमें वे विधियाँ शामिल हैं जो डीएनए को पूरी तरह से काटने पर निर्भर करती हैं और नई विधियाँ जो नए कोड को लिखने के लिए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया का उपयोग करती हैं। आमने-सामने के परीक्षणों में, नया दृष्टिकोण लगातार दूसरों से बेहतर रहा, जिसने उच्च सफलता दर और स्वच्छ परिणाम दिए। इसने उन कोशिकाओं में भी एक अनूठा लाभ दिखाया जो सक्रिय रूप से विभाजित नहीं हो रही थीं, एक ऐसी स्थिति जहाँ अन्य कई संपादन उपकरण पूरी तरह से विफल हो जाते हैं। हालांकि शोधकर्ता नोट करते हैं कि कोशिका इन निक्स को कैसे संसाधित करती है, इसके सटीक आणविक नृत्य को अभी भी पूरी तरह से समझने की आवश्यकता है, डेटा स्पष्ट रूप से दिखाता है कि यह विधि सटीक जीनोम लेखन के लिए एक विशिष्ट और श्रेष्ठ मार्ग प्रदान करती है। डबल-स्ट्रैंड ब्रेक या जटिल एंजाइमेटिक चरणों की आवश्यकता के बिना बड़े आनुवंशिक भार डालने की क्षमता को जोड़कर, यह कार्य कम जोखिम के साथ अधिक सटीकता के साथ कोशिकाओं को इंजीनियर करने के लिए एक नया द्वार खोलता है।