Cas9 nickase-mediated gene editing enables precise large-fragment integration with minimal byproducts
本文介绍了由 Nickase 介导的基因编辑（NKGE），这是一种使用 Cas9(H840A) 的新型配对切口酶策略，通过利用局部单链切口和短同源臂，实现了精确的大片段 DNA 整合且副产物极少，从而在性能上超越了现有的 HDR 和先导编辑（prime-editing）方法。
原始论文采用 CC BY 4.0 许可（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）。 这是一篇未经同行评审的预印本的AI生成解释。这不是医疗建议。请勿根据此内容做出健康决定。 阅读完整免责声明
在活细胞内重写遗传密码的能力改变了生物学，为治愈曾经被认为无法攻克的疾病带来了希望。这场革命的核心是那些充当“分子剪刀”的工具，它们可以在特定的位置切割DNA，从而引导细胞的自然修复机制去修复损坏的基因或插入一个新基因。多年来，最常用的方法依赖于在DNA螺旋中制造一个完整的双链断裂。虽然这种方法很有效，但往往会导致细胞陷入“恐慌”，并以一种混乱的方式缝补伤口，从而导致意外的突变或附近的非预期变化。其他较新的方法试图完全避免断裂，使用更精细的工具直接写入新信息，但在需要插入大块遗传物质的任务面前，这些方法往往显得力不从心。挑战在于寻找一种既能精确安装大量新DNA，又不会造成附带损伤，且不需要细胞处于特定生长状态的方法。
清华大学的一个研究小组开发了一种绕过这些旧有局限性的新方法。他们没有将DNA链完全切断成两半，而是使用了一种改良版的分子剪刀，在DNA螺旋的两条链上分别制造两个微小的单侧切口（nicks）。想象一下拉链，如果拉链的齿在其中一侧稍微分离，然后在另一侧也稍微分离，就会创造出一个微小的局部间隙，而不会破坏拉链的主体结构。研究人员称这种技术为NKGE，它创造了一个短暂的窗口，让细胞的修复机制可以抓取一段供体DNA并将其滑入到位。因为DNA从未被完全切断，所以细胞不会触发通常会导致错误的紧急修复程序。其结果是，该系统能够以极高的精确度插入大块遗传物质，几乎不留下任何多余的副产物。
研究人员使用一套精密的报告系统测试了这种方法，该系统旨在准确展示细胞内部发生的情况。他们创建了一个设置：精准的插入会使细胞发出两种颜色的荧光，而任何混乱、易错的修复则只会发出一种颜色。通过调整两个微小切口之间的距离，他们发现了一个清晰的模式：切口之间的距离越远，发生的错误就越少。至关重要的是，当他们提供一段待插入的供体DNA时，错误进一步减少，正确的、具有两种颜色的插入成为了主要结果。这证明了该方法能够主动引导细胞远离犯错，转向预期的修复。他们发现，即使在供体DNA量非常少的情况下，该系统依然能高效工作，比以往的方法所需的材料要少得多。
其中一个最令人惊讶的发现是哪种类型的DNA片段效果最好。研究人员最初预计，供体DNA需要具有特定的、带有锯齿状的末端，以便与切口处契合，就像拼图块需要特定形状一样。然而，他们发现简单的、直边的DNA片段效果甚至更好。细胞自身的内部酶似乎会自动处理这些直边，为插入做好准备，而无需科学家进行额外的步骤。这显著简化了过程，消除了在将DNA片段引入细胞前进行复杂实验室准备的需求。
当团队测试该方法插入大片段DNA的能力时，其真正的威力显现了出来。在以往的尝试中，插入长度超过几百个字母的遗传物质是非常困难且低效的。利用这种新方法，研究人员成功地在人类细胞中插入了长达10,000个字母的DNA片段。他们在多种类型的人类细胞中进行了测试，包括那些分裂不活跃的细胞，并发现该方法在各种情况下都能稳定工作。在许多案例中，插入这些大片段的效率比现有的最佳替代方案高出六倍以上。此外，当他们检查基因组的其他部分是否存在非预期的变化时，并未发现任何异常，证实了该方法具有高度的特异性和安全性。
该研究还将这种新技术与领域内的当前金标准进行了对比，包括依赖于完全切割DNA的方法，以及使用逆转录过程来编写新代码的新型方法。在面对面的测试中，这种新方法表现始终优于其他方法，提供了更高的成功率和更干净的结果。它还展现出了在非活跃分裂细胞中的独特优势，而在这种场景下，许多其他基因编辑工具会完全失效。尽管研究人员指出，细胞如何处理这些切口的精确分子机制仍需进一步了解，但数据清楚地表明，这种方法为精确的基因组写作提供了一条独特且卓越的路径。通过将插入大型遗传载荷的能力与对双链断裂或复杂酶促步骤的需求解耦，这项工作为以更高精度、更低风险进行细胞工程开启了一扇新的大门。
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