Cas9 nickase-mediated gene editing enables precise large-fragment integration with minimal byproducts

살아있는 세포 내부의 유전 코드를 재작성하는 능력은 생물학을 변화시켰으며, 한때 불가능하다고 여겨졌던 질병들을 치료할 수 있다는 희망을 제시하고 있습니다. 이 혁신의 중심에는 분자 가위와 같은 역할을 하는 도구들이 있는데, 이들은 DNA의 특정 위치를 절단하여 세포의 자연적인 복구 메커니즘이 고장 난 유전자를 고치거나 새로운 유전자를 삽입하도록 유도합니다. 수년 동안 가장 흔한 방법은 DNA 나선 구조에서 완전한 이중 가닥 절단을 만드는 것에 의존했습니다. 이 방식은 효과적이긴 했지만, 종종 세포가 공황 상태에 빠져 상처를 지저분하게 봉합하게 만들어, 의도치 않은 돌연변이나 주변의 원치 않는 변화를 초과하는 결과를 초래했습니다. 다른 최신 방법들은 절단을 완전히 피하고 더 섬세한 도구를 사용하여 새로운 정보를 직접 쓰는 방식을 시도했지만, 이러한 방식들은 큰 덩어리의 유전 물질을 삽입해야 하는 작업에서는 어려움을 겪는 경우가 많았습니다. 과제는 부수적인 피해를 입히지 않으면서, 또한 세포가 특정한 성장 상태에 있을 필요 없이 상당한 양의 새로운 DNA를 정밀하게 설치하는 방법을 찾는 것이었습니다.

칭화대학교의 연구팀은 이러한 오래된 한계들을 우회하는 새로운 접근 방식을 개발했습니다. DNA 가닥을 완전히 두 토막으로 자르는 대신, 그들은 DNA 나선의 반대쪽 가닥들에 두 개의 작은 단일 가닥 닉(nick, 끊김)을 만드는 변형된 분자 가위를 사용합니다. 지퍼의 이빨이 한쪽 면에서 약간 떨어져 있고 다른 쪽에서도 다시 떨어져 있어, 지퍼의 주요 구조는 깨뜨리지 않으면서 국소적인 틈을 만드는 지퍼를 상상해 보십시오. 연구진이 NKGE라고 부르는 이 기술은 세포의 복구 기구가 공여 DNA 조각을 붙잡아 제 자리에 밀어 넣을 수 있는 짧은 창을 만들어냅니다. DNA가 결코 완전히 절단되지 않기 때문에, 세포는 오류를 일으키는 데 흔히 나타나는 비상 복구 경로를 작동시키지 않습니다. 그 결과, 이 시스템은 부수적인 부산물을 거의 남기지 않으면서 놀라운 정밀도로 대량의 유전 물질을 삽입할 수 있습니다.

연구진은 세포 내부에서 정확히 어떤 일이 일어나는지 보여주기 위해 설계된 정교한 보고 시스템을 사용하여 이 방법을 테스트했습니다. 그들은 정밀한 삽입이 일어나면 세포를 두 가지 색의 형광으로 밝히고, 지저분하고 오류가 발생하기 쉬운 복구가 일어나면 한 가지 색으로만 밝게 빛나도록 설정했습니다. 두 개의 작은 닉 사이의 거리를 조정하면서, 그들은 명확한 패턴을 발견했습니다: 닉 사이의 거리가 멀어질수록 오류가 적게 발생했습니다. 결정적으로, 삽열할 공여 DNA 조각을 제공했을 때 오류는 더욱 감소했으며, 올바른 두 가지 색의 삽입이 지배적인 결과가 되었습니다. 이는 이 방법이 세포를 실수를 유도하는 방향에서 벗어나 원하는 복구 방향으로 능동적으로 안내한다는 것을 증명했습니다. 그들은 이 시스템이 매우 적은 양의 공여 DNA로도 효율적으로 작동하며, 이전 방법들보다 훨씬 적은 양의 재료를 필요로 한다는 것을 발견했습니다.

가장 놀라운 발견 중 하나는 어떤 유형의 DNA 조각이 가장 잘 작동하는가였습니다. 연구진은 처음에 공여 DNA가 퍼즐 조각이 특정 모양을 가져야 하는 것처럼 닉이 있는 부위에 맞도록 특정한 톱니 모양의 끝을 가져야 할 것이라고 예상했습니다. 그러나 그들은 단순하고 직선 형태의 끝을 가진 DNA 조각이 훨씬 더 잘 작동한다는 것을 발견했습니다. 세포 자체의 내부 효소들이 이러한 직선 형태의 끝을 자동으로 처리하여, 과학자들의 추가적인 단계 없이도 삽입할 수 있도록 준비하는 것으로 보입니다. 이는 과정을 크게 단순화하여, 세포에 도입하기 전 DNA 조각에 대한 복잡한 실험실 준비 과정을 제거해 줍니다.

이 새로운 방법의 진정한 힘은 연구팀이 큰 DNA 단편을 삽입하는 능력을 테스트했을 때 분명하게 드러났습니다. 이전의 시도들에서는 수백 개의 글자보다 큰 유전 물질을 삽입하는 것이 어렵고 비효율적이었습니다. 이 새로운 접근 방식을 사용하여, 연구진은 인간 세포에 최대 10,000개의 글자로 이루어진 DNA 단편을 성공적으로 삽입했습니다. 그들은 빠르게 분열하지 않는 세포를 포함한 다양한 종류의 인간 세포에서 이 방법을 테스트했으며, 이 방법이 전반적으로 일관되게 작동한다는 것을 발견했습니다. 많은 경우, 이러한 큰 조각을 삽입하는 효율은 기존의 가장 뛰어난 대안들보다 6배 이상 높았습니다. 더욱이, 게놈의 다른 부분에서 의도하지 않은 변화가 있는지 살펴보았을 때, 아무것도 발견되지 않았으며, 이는 이 방법이 매우 특이적이고 안전하다는 것을 확인시켜 주었습니다.

또한 이 연구는 이중 가닥을 완전히 절단하는 방식이나 새로운 코드를 쓰기 위해 역전사 과정을 사용하는 최신 방법들을 포함하여, 현재 이 분야의 골드 표준들과 이 새로운 기술을 비교했습니다. 직접적인 대결 테스트에서, 이 새로운 접근 방식은 다른 방식들을 지속적으로 능가하며 더 높은 성공률과 더 깨끗한 결과를 전달했습니다. 또한 세포가 활발히 분열하지 않는 상황에서도 독특한 이점을 보여주었는데, 이는 많은 다른 편집 도구들이 완전히 실패하는 시나리오입니다. 연구진은 세포가 이러한 닉을 처리하는 정확한 분자적 과정이 아직 완전히 이해될 필요가 있다고 언급했지만, 데이터는 이 방법이 정밀한 게놈 작성을 위한 뚜렷하고 우월한 경로를 제공한다는 것을 명확히 보여줍니다. 이 작업은 이중 가닥 절단이나 복잡한 효소 단계의 필요성 없이도 큰 유전적 페이로드를 삽입할 수 있는 능력을 결합함으로써, 더 높은 정밀도와 더 적은 위험으로 세포를 엔지니어링할 수 있는 새로운 문을 열어주었습니다.