Label-free SERS Discrimination of Native Proline Hydroxylation at Single-molecule peptide by Deep Learning-assisted plasmonic nanopore

Sintesi Tecnica: Discriminazione SERS senza marcatura dell'idrossilazione nativa della prolina in peptidi a singola molecola mediante nanoporo plasmonico assistito da deep learning

Enunciato del Problema
Le modificazioni post-traduzionali (PTM), in particolare l'idrossilazione della prolina in posizione 4 del fattore 1α indotto dall'ipossia (HIF-1α), sono fondamentali per la regolazione della segnalazione cellulare e della progressione tumorale. Tuttavia, la discriminazione di frammenti peptidici idrossilati da quelli non idrossilati a livello di singola molecola rimane una sfida significativa. I metodi esistenti presentano limitazioni distinte: la spettrometria di massa richiede un alto numero di copie molecolari ($10^6$–$10^8$) e soffre di interpretazioni errate dovute a regole combinatorie alterate; la rilevazione di impulsi resistivi tramite nanopori fornisce letture indirette codificate nelle ampiezze di blocco della corrente piuttosto che impronte digitali chimiche dirette; e la Spettroscopia Raman potenziata da superficie (SERS) convenzionale fatica con le sezioni d'urto Raman deboli dell'idrossilazione, la sovrapposizione spettrale con lo scheletro peptidico e l'eterogeneità nelle configurazioni di adsorbimento molecolare e nei punti caldi elettromagnetici. Di conseguenza, il rilevamento di firme PTM sottili come l'idrossilazione in sistemi peptidici complessi è ostacolato da una bassa riproducibilità e da difficoltà nell'interpretazione spettrale.

Metodologia
Gli autori hanno sviluppato una piattaforma ibrida che combina un sensore SERS a singola molecola di tipo "particella in poro" con analisi statistica degli spettri e deep learning.

1. Piattaforma SERS "Particella in Poro": Il sistema utilizza una matrice di nanofore d'oro (pori di diametro 250 nm in un film d'oro di 100 nm su una membrana di SiN) integrata in un dispositivo microfluidico. Nanoparticelle d'oro (AuNP) di 50 nm caricate di peptidi vengono spinte attraverso i pori mediante elettroforesi ed elettroosmosi. Un laser a 785 nm esercita una forza ottica, intrappolando l'AuNP contro la parete laterale del poro. Questa configurazione crea un punto caldo plasmonico confinato tra l'AuNP e la parete del poro, consentendo sensibilità a singola molecola minimizzando al contempo la copertura del segnale dello scheletro.
2. Sistemi Peptidici: Sono stati sintetizzati tre coppie di peptidi frammento di HIF-1α contenenti il sito di idrossilazione Pro-564, con lunghezze di 7, 9 e 15 amminoacidi (AA). Le varianti non idrossilate (HIF7S, HIF9S, HIF15S) e idrossilate (HIF7SPTM, HIF9SPTM, HIF15SPTM) sono state adsorbite fisicamente su AuNP ricoperti di citrato per formare monostrati.
3. Acquisizione e Elaborazione Dati: Gli spettri Raman in serie temporale sono stati raccolti durante gli eventi di intrappolamento delle nanoparticelle. Oltre 6.800 spettri efficaci per dataset sono stati pre-elaborati (correzione della linea di base, rimozione dei raggi cosmici, normalizzazione).
4. Analisi Statistica (POF): Per affrontare le fluttuazioni spettrali a singola molecola, gli autori hanno impiegato l'analisi della Frequenza di Occorrenza dei Picchi (POF). Questo metodo aggrega grandi dataset per ricostruire profili spettrali rappresentativi, identificando caratteristiche spettrali riproducibili basate sulla frequenza di apparizione dei picchi a specifici spostamenti Raman piuttosto che sull'intensità assoluta.
5. Classificazione tramite Deep Learning: Una rete neurale convoluzionale monodimensionale (1D-CNN) è stata addestrata per classificare i peptidi idrossilati rispetto a quelli non idrossilati utilizzando l'intero dato spettrale. L'interpretabilità del modello è stata potenziata utilizzando la Mappatura dell'Attivazione della Classe pesata dal Gradiente (Grad-CAM) per visualizzare quali regioni spettrali hanno guidato le decisioni di classificazione.

Risultati Chiave

• Firme Spettrali e Cambiamenti di Adsorbimento: L'analisi POF ha rivelato cambiamenti spettrali riproducibili dipendenti dall'idrossilazione. Per i peptidi da 7AA e 9AA, l'idrossilazione ha soppresso la banda Met $\nu$(C–S) a ~680 cm⁻¹ e potenziato le bande vicino a 712, 1016, 1121 e 1234 cm⁻¹. Ciò suggerisce uno spostamento della conformazione di adsorbimento da un'orientazione dominata dalla Met a configurazioni alternative che coinvolgono interazioni dell'anello della Tirosina (Tyr) o le estremità peptidiche.
• Accuratezza di Discriminazione: La 1D-CNN ha raggiunto accuratezze di classificazione su singolo spettro post-valutazione del 72,98% (7AA), 78,55% (9AA) e 89,74% (15AA). I valori dell'Area Sotto la Curva (AUC) sono stati rispettivamente 0,80, 0,88 e 0,96. Notevolmente, l'accuratezza è aumentata con la lunghezza del peptide, contrariamente all'aspettativa che peptidi più lunghi e complessi sarebbero stati più difficili da distinguere.
• Amplificazione Mediata dall'Adsorbimento nei Peptidi più Lunghi: Per la coppia di peptidi da 15AA, la variante idrossilata (HIF15SPTM) ha mostrato una POF significativamente più alta per la banda associata al citrato a 1073 cm⁻¹ (0,266) rispetto alla variante non idrossilata (0,033). Ciò indica che l'idrossilazione altera la conformazione del peptide o l'affinità superficiale, riducendo l'efficienza di adsorbimento e lasciando più citrato sulla superficie dell'AuNP. Questo effetto mediato dall'adsorbimento ha amplificato le differenze spettrali, contribuendo alla superiore accuratezza di discriminazione (AUC > 0,96) per la coppia da 15AA.
• Interpretabilità del Modello: La visualizzazione Grad-CAM ha confermato che le regioni spettrali sensibili della CNN sovrapponevano le caratteristiche POF ricorrenti identificate come dipendenti dall'idrossilazione. Sono state osservate pesi di caratteristiche elevati a 680, 712, 1016, 1121 e 1234 cm⁻¹, nonché nella regione del citrato (1073 cm⁻¹) per i peptidi da 15AA, validando la rilevanza chimica dei pattern appresi.

Significato e Affermazioni
Il documento afferma che l'integrazione della SERS a singola molecola di tipo "particella in poro" con l'analisi POF e il deep learning fornisce una strategia robusta per l'analisi ultrasensibile di deboli firme PTM. I contributi chiave includono:

1. Superamento dell'Eterogeneità Spettrale: Lo studio dimostra che la ricostruzione statistica (POF) e il deep learning possono estrarre efficacemente pattern discriminativi dai dati intrinsecamente eterogenei e rumorosi della SERS a singola molecola.
2. Insight Meccanicistico: Il lavoro rivela che la discriminazione non si basa esclusivamente sulle differenze vibrazionali intrinseche del gruppo idrossile, ma è significativamente amplificata dai cambiamenti indotti dall'idrossilazione nel comportamento di adsorbimento del peptide e nelle interazioni superficiali (ad esempio, spostamento del citrato).
3. Scalabilità: Il metodo ha discriminato con successo le PTM in peptidi di crescente complessità strutturale (fino a 15 AA), suggerendo che i cambiamenti spettrali mediati dall'adsorbimento possano diventare più pronunciati in sistemi più grandi, facilitando così piuttosto che ostacolando il rilevamento.
4. Rilevamento senza Marcatura: L'approccio offre un'alternativa senza marcatura alla spettrometria di massa e ai metodi basati su anticorpi per il rilevamento di PTM a bassa abbondanza, potenzialmente consentendo diagnosi precoci di malattie e lo studio della dinamica proteica a livello di singola molecola.

Gli autori concludono che questo framework fornisce una via promettente per l'analisi di cambiamenti strutturali e chimici sottili nelle biomolecole, colmando il divario tra il sensing a singola molecola e l'interpretazione biologica complessa.