Label-free SERS Discrimination of Native Proline Hydroxylation at Single-molecule peptide by Deep Learning-assisted plasmonic nanopore

Technische Samenvatting: Label-vrije SERS-discriminatie van native prolylhydroxylering op single-molecule peptiden door deep learning-ondersteunde plasmonische nanopore

Probleemstelling
Post-translationele modificaties (PTM's), specifiek de prolyl-4-hydroxylering van hypoxie-induceerbaar factor-1α (HIF-1α), zijn cruciaal voor de regulatie van celsignaleren en kankerprogressie. Het onderscheiden van gehydroxyleerde van niet-gehydroxyleerde peptidefragmenten op single-molecule niveau blijft echter een aanzienlijke uitdaging. Bestaande methoden hebben verschillende beperkingen: massaspectrometrie vereist hoge moleculaire kopieaantallen ($10^6$–$10^8$) en lijdt aan valse interpretaties door gewijzigde combinatorische regels; nanopore-resistieve pulsensensing biedt indirecte uitlezingen die zijn gecodeerd in de amplitude van stroomblokkades in plaats van directe chemische vingerafdrukken; en conventionele Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) kampt met zwakke Raman-kruissecties van hydroxylering, spectrale overlapping met de peptide-ruggengraat, en heterogeniteit in moleculaire adsorptieconfiguraties en elektromagnetische hotspots. Bijgevolg wordt het detecteren van subtiele PTM-signaturen zoals hydroxylering in complexe peptidesystemen gehinderd door lage reproduceerbaarheid en moeilijkheden bij spectrale interpretatie.

Methodologie
De auteurs ontwikkelden een hybride platform dat een "particle-in-pore" single-molecule SERS-sensor combineert met statistische spectrale analyse en deep learning.

1. Particle-in-Pore SERS-platform: Het systeem maakt gebruik van een goud-nanogatarray (250 nm diameter gaten in een 100 nm goudfilm op een SiN-membraan) geïntegreerd in een microfluïdisch apparaat. Peptide-beladen 50 nm goudnanodeeltjes (AuNPs) worden door electrophorese en electroosmose door de gaten gedreven. Een 785 nm-laser oefent een optische kracht uit en vangt het AuNP tegen de gatwand. Deze configuratie creëert een beperkte plasmonische hotspot tussen het AuNP en de gatwand, waardoor single-molecule gevoeligheid wordt bereikt terwijl de achtergrondsignaaldekking van de ruggengraat wordt geminimaliseerd.
2. Peptidesystemen: Drie paren HIF-1α-fragmentpeptiden die de Pro-564 hydroxyleringsplaats bevatten, werden gesynthetiseerd met lengtes van 7, 9 en 15 aminozuren (AAs). Niet-gehydroxyleerde (HIF7S, HIF9S, HIF15S) en gehydroxyleerde (HIF7SPTM, HIF9SPTM, HIF15SPTM) varianten werden fysiek geadsorbeerd op met citraat omhulde AuNPs om monolagen te vormen.
3. Data-acquisitie en verwerking: Tijdreeks-Ramanspectra werden verzameld tijdens nanoparticle-vanggebeurtenissen. Meer dan 6.800 effectieve spectra per dataset werden voorbewerkt (baseline-correctie, verwijdering van kosmische straling, normalisatie).
4. Statistische analyse (POF): Om single-molecule spectrale fluctuaties aan te pakken, pasten de auteurs Peak Occurrence Frequency (POF)-analyse toe. Deze methode aggregeert grote datasets om representatieve spectrale profielen te reconstrueren, waarbij reproduceerbare spectrale kenmerken worden geïdentificeerd op basis van de frequentie van piekverschijning bij specifieke Raman-verschuivingen in plaats van absolute intensiteit.
5. Deep learning-classificatie: Een een-dimensionaal convolutioneel neuronaal netwerk (1D-CNN) werd getraind om gehydroxyleerde van niet-gehydroxyleerde peptiden te classificeren aan de hand van de volledige spectrale data. Modelinterpreteerbaarheid werd verbeterd door Gradient-weighted Class Activation Mapping (Grad-CAM) te gebruiken om te visualiseren welke spectrale gebieden de classificatiebeslissingen aandreven.

Belangrijkste resultaten

• Spectrale signatures en veranderingen in adsorptie: POF-analyse onthulde reproduceerbare, hydroxyleringsafhankelijke spectrale veranderingen. Voor de 7AA- en 9AA-peptiden onderdrukte hydroxylering de Met $\nu$(C–S)-band bij ~680 cm⁻¹ en versterkte banden nabij 712, 1016, 1121 en 1234 cm⁻¹. Dit suggereert een verschuiving in adsorptieconformatie van een Met-gedomineerde oriëntatie naar alternatieve configuraties die interacties van Tyrosine (Tyr)-ringen of peptide-einden omvatten.
• Discriminatie-nauwkeurigheid: De 1D-CNN bereikte na evaluatie single-spectrum classificatienauwkeurigheden van 72,98% (7AA), 78,55% (9AA) en 89,74% (15AA). De Area Under the Curve (AUC)-waarden waren respectievelijk 0,80, 0,88 en 0,96. Opmerkelijk is dat de nauwkeurigheid toenam met de peptidelengte, in tegenstelling tot de verwachting dat langere, complexere peptiden moeilijker te onderscheiden zouden zijn.
• Adsorptie-gemedieerde versterking in langere peptiden: Voor het 15AA-peptidepaar vertoonde de gehydroxyleerde variant (HIF15SPTM) een aanzienlijk hogere POF voor de met citraat geassocieerde band bij 1073 cm⁻¹ (0,266) vergeleken met de niet-gehydroxyleerde variant (0,033). Dit geeft aan dat hydroxylering de peptideconformatie of oppervlakteaffiniteit verandert, wat de adsorptie-efficiëntie vermindert en meer citraat op het AuNP-oppervlak achterlaat. Dit adsorptie-gemedieerde effect versterkte de spectrale verschillen, wat bijdroeg aan de superieure discriminatienauwkeurigheid (AUC > 0,96) voor het 15AA-paar.
• Modelinterpreteerbaarheid: Grad-CAM-visualisatie bevestigde dat de gevoelige spectrale gebieden van de CNN overlappen met de terugkerende POF-kenmerken die als hydroxyleringsafhankelijk zijn geïdentificeerd. Hoge feature-weights werden waargenomen bij 680, 712, 1016, 1121 en 1234 cm⁻¹, evenals het citraatgebied (1073 cm⁻¹) voor de 15AA-peptiden, wat de chemische relevantie van de geleerde patronen valideert.

Betekenis en claims
Het artikel beweert dat de integratie van particle-in-pore single-molecule SERS met POF-analyse en deep learning een robuuste strategie biedt voor de ultrasensitieve analyse van zwakke PTM-signaturen. Belangrijke bijdragen zijn:

1. Overcoming Spectral Heterogeneity: De studie toont aan dat statistische reconstructie (POF) en deep learning effectief discriminerende patronen kunnen extraheren uit de inherent heterogene en ruige data van single-molecule SERS.
2. Mechanistisch inzicht: Het werk onthult dat discriminatie niet uitsluitend gebaseerd is op intrinsieke vibratieverschillen van de hydroxylgroep, maar significant wordt versterkt door door hydroxylering veroorzaakte veranderingen in peptide-adsorptiegedrag en oppervlakte-interacties (bijv. citraatverplaatsing).
3. Schaalbaarheid: De methode discrimineerde PTM's succesvol in peptiden met toenemende structurele complexiteit (tot 15 AA), wat suggereert dat adsorptie-gemedieerde spectrale veranderingen in grotere systemen meer uitgesproken kunnen worden, waardoor detectie wordt geholpen in plaats van gehinderd.
4. Label-vrije detectie: De aanpak biedt een label-vrij alternatief voor massaspectrometrie en antilichaam-gebaseerde methoden voor het detecteren van PTM's met lage abundantie, wat potentieel vroege ziektediagnose en het bestuderen van proteïnedynamica op single-molecule niveau mogelijk maakt.

De auteurs concluderen dat dit kader een veelbelovende weg biedt voor het analyseren van subtiele structurele en chemische veranderingen in biomoleculen, en de kloof overbrugt tussen single-molecule sensing en complexe biologische interpretatie.