Label-free SERS Discrimination of Native Proline Hydroxylation at Single-molecule peptide by Deep Learning-assisted plasmonic nanopore

Resumo Técnico: Discriminação sem Marcadores de Hidroxilação de Prolina Nativa em Peptídeos de Molécula Única por SERS Assistida por Aprendizado Profundo em Nanoporo Plasmônico

Declaração do Problema
Modificações pós-traducionais (MPTs), especificamente a 4-hidroxilação de prolina do fator induzível por hipóxia-1α (HIF-1α), são críticas para a regulação da sinalização celular e da progressão do câncer. No entanto, discriminar fragmentos peptídicos hidroxilados de não hidroxilados no nível de molécula única permanece um desafio significativo. Métodos existentes enfrentam limitações distintas: a espectrometria de massa requer altos números de cópias moleculares ($10^6$–$10^8$) e sofre de interpretações falsas devido a regras combinatórias alteradas; a detecção de pulsos resistivos em nanoporos fornece leituras indiretas codificadas nas amplitudes de bloqueio de corrente em vez de impressões digitais químicas diretas; e a Espectroscopia Raman Amplificada por Superfície (SERS) convencional luta com seções de choque Raman fracas da hidroxilação, sobreposição espectral com a espinha dorsal do peptídeo e heterogeneidade nas configurações de adsorção molecular e pontos quentes eletromagnéticos. Consequentemente, a detecção de assinaturas sutis de MPTs como a hidroxilação em sistemas peptídicos complexos é prejudicada por baixa reprodutibilidade e dificuldades na interpretação espectral.

Metodologia
Os autores desenvolveram uma plataforma híbrida combinando um sensor SERS de molécula única do tipo "partícula-em-poro" com análise estatística de espectros e aprendizado profundo.

1. Plataforma SERS Partícula-em-Poro: O sistema utiliza uma matriz de nanofuros de ouro (poros de 250 nm de diâmetro em um filme de ouro de 100 nm sobre uma membrana de SiN) integrada a um dispositivo microfluídico. Nanopartículas de ouro (AuNPs) de 50 nm carregadas com peptídeos são impulsionadas através dos poros por eletroforese e eletroosmose. Um laser de 785 nm exerce uma força óptica, aprisionando a AuNP contra a parede lateral do poro. Esta configuração cria um ponto quente plasmônico confinado entre a AuNP e a parede do poro, permitindo sensibilidade de molécula única enquanto minimiza a cobertura do sinal da espinha dorsal.
2. Sistemas Peptídicos: Três pares de peptídeos de fragmento de HIF-1α contendo o sítio de hidroxilação Pro-564 foram sintetizados com comprimentos de 7, 9 e 15 aminoácidos (AAs). Variantes não hidroxiladas (HIF7S, HIF9S, HIF15S) e hidroxiladas (HIF7SPTM, HIF9SPTM, HIF15SPTM) foram adsorvidas fisicamente em AuNPs revestidas com citrato para formar monocamadas.
3. Aquisição e Processamento de Dados: Espectros Raman em série temporal foram coletados durante eventos de aprisionamento de nanopartículas. Mais de 6.800 espectros efetivos por conjunto de dados foram pré-processados (correção de linha de base, remoção de raios cósmicos, normalização).
4. Análise Estatística (POF): Para abordar flutuações espectrais de molécula única, os autores empregaram análise de Frequência de Ocorrência de Picos (POF). Este método agrega grandes conjuntos de dados para reconstruir perfis espectrais representativos, identificando características espectrais reprodutíveis com base na frequência de aparecimento de picos em deslocamentos Raman específicos, em vez de intensidade absoluta.
5. Classificação por Aprendizado Profundo: Uma rede neural convolucional unidimensional (1D-CNN) foi treinada para classificar peptídeos hidroxilados versus não hidroxilados usando os dados espectrais completos. A interpretabilidade do modelo foi aprimorada usando Mapeamento de Ativação de Classe Ponderado por Gradiente (Grad-CAM) para visualizar quais regiões espectrais impulsionaram as decisões de classificação.

Principais Resultados

• Assinaturas Espectrais e Alterações de Adsorção: A análise POF revelou mudanças espectrais reprodutíveis e dependentes da hidroxilação. Para os peptídeos de 7AA e 9AA, a hidroxilação suprimiu a banda Met $\nu$(C–S) em ~680 cm⁻¹ e intensificou bandas próximas a 712, 1016, 1121 e 1234 cm⁻¹. Isso sugere uma mudança na conformação de adsorção de uma orientação dominada por Met para configurações alternativas envolvendo interações do anel de Tirosina (Tyr) ou terminais peptídicos.
• Precisão de Discriminação: A 1D-CNN alcançou precisões de classificação de espectro único pós-avaliação de 72,98% (7AA), 78,55% (9AA) e 89,74% (15AA). Os valores de Área sob a Curva (AUC) foram 0,80, 0,88 e 0,96, respectivamente. Notavelmente, a precisão aumentou com o comprimento do peptídeo, contrariando a expectativa de que peptídeos mais longos e complexos seriam mais difíceis de distinguir.
• Amplificação Mediada por Adsorção em Peptídeos Mais Longos: Para o par de peptídeos de 15AA, a variante hidroxilada (HIF15SPTM) exibiu uma POF significativamente maior para a banda associada ao citrato em 1073 cm⁻¹ (0,266) em comparação com a variante não hidroxilada (0,033). Isso indica que a hidroxilação altera a conformação do peptídeo ou a afinidade superficial, reduzindo a eficiência de adsorção e deixando mais citrato na superfície da AuNP. Este efeito mediado por adsorção amplificou as diferenças espectrais, contribuindo para a precisão de discriminação superior (AUC > 0,96) para o par de 15AA.
• Interpretabilidade do Modelo: A visualização Grad-CAM confirmou que as regiões espectrais sensíveis da CNN sobrepostas às características POF recorrentes identificadas como dependentes da hidroxilação. Pesos de características elevados foram observados em 680, 712, 1016, 1121 e 1234 cm⁻¹, bem como na região do citrato (1073 cm⁻¹) para os peptídeos de 15AA, validando a relevância química dos padrões aprendidos.

Significado e Alegações
O artigo afirma que a integração de SERS de molécula única do tipo partícula-em-poro com análise POF e aprendizado profundo fornece uma estratégia robusta para a análise ultra-sensível de assinaturas fracas de MPTs. As principais contribuições incluem:

1. Superação da Heterogeneidade Espectral: O estudo demonstra que a reconstrução estatística (POF) e o aprendizado profundo podem efetivamente extrair padrões discriminativos dos dados inerentemente heterogêneos e ruidosos do SERS de molécula única.
2. Insight Mecanístico: O trabalho revela que a discriminação não se baseia apenas em diferenças vibracionais intrínsecas do grupo hidroxila, mas é significativamente amplificada por mudanças induzidas pela hidroxilação no comportamento de adsorção do peptídeo e nas interações superficiais (por exemplo, deslocamento de citrato).
3. Escalabilidade: O método discriminou com sucesso MPTs em peptídeos de complexidade estrutural crescente (até 15 AA), sugerindo que mudanças espectrais mediadas por adsorção podem se tornar mais pronunciadas em sistemas maiores, auxiliando em vez de dificultar a detecção.
4. Detecção sem Marcadores: A abordagem oferece uma alternativa sem marcadores à espectrometria de massa e a métodos baseados em anticorpos para detectar MPTs de baixa abundância, potencialmente permitindo diagnóstico precoce de doenças e o estudo da dinâmica de proteínas no nível de molécula única.

Os autores concluem que este quadro fornece um caminho promissor para analisar mudanças estruturais e químicas sutis em biomoléculas, preenchendo a lacuna entre a detecção de molécula única e a interpretação biológica complexa.