Taxonomic profilers and their influence on metagenomic diversity analyses

Immagina di essere un detective che cerca di risolvere un mistero: "Chi vive in questa città minuscola e invisibile?". Nel mondo della ricerca sul microbioma, quella città è un campione di terra, saliva o feci, e i suoi residenti sono miliardi di minuscoli microbi. Per scoprire chi vi abita, gli scienziati utilizzano strumenti software speciali chiamati profilatori tassonomici. Questi strumenti agiscono come bibliotecari super veloci, scansionando milioni di "pagine" di DNA e confrontandole con una gigantesca biblioteca di riferimento di microbi noti per creare una lista degli ospiti.

Ma ecco il colpo di scena: proprio come diversi bibliotecari potrebbero usare cataloghi diversi o avere regole diverse su cosa conti come un "ospite", questi strumenti software non sempre concordano sulla lista degli ospiti. Questo articolo, guidato da Jonathan Rondeau-Leclaire e dai suoi colleghi, ha deciso di mettere alla prova quattro dei "bibliotecari" più popolari (mOTUs, MetaPhlAn, Kraken2 e Sourmash). Non si sono limitati a guardare dati finti o inventati; hanno scavato in 1.211 metagenomi reali provenienti da otto dataset differenti, che spaziano dagli intestini umani e la pelle fino al muschio e l'intestino delle api.

Il Grande Disaccordo sulla Lista degli Ospiti

Il team ha scoperto che la scelta del bibliotecario cambia significativamente la storia. Se chiedi a uno strumento di contare gli ospiti, potrebbe dire: "Wow, ci sono 500 specie diverse!". Chiedi a un altro strumento, e potrebbe dire: "In realtà, ne vedo solo 200".

L'articolo ha scoperto che la diversità alfa (un modo elegante per dire "quanti tipi diversi di ospiti ci sono nella stanza e quanto sono distribuiti uniformemente") è estremamente sensibile allo strumento scelto.

• I Bibliotecari "dal DNA ai Marcatori": Strumenti come MetaPhlAn e mOTUs cercano "cartellini del nome" (geni marcatori) sui microbi. Anche utilizzando lo stesso tipo di libreria, questi due strumenti hanno fornito conteggi di diversità differenti. Ad esempio, mOTUs4 ha trovato una diversità maggiore rispetto a MetaPhlAn4 nel 95,5% dei campioni osservando la diversità di Shannon.
• I Bibliotecari "dal DNA al DNA": Strumenti come Kraken2 e Sourmash confrontano l'intera sequenza di DNA, come se stessero accostando interi paragrafi. Questi mostravano oscillazioni ancora più selvagge. Usando lo stesso database, Kraken2 riportava spesso molte più specie rispetto a Sourmash. Infatti, con un'impostazione specifica, Kraken2 ha trovato una media di 1.167 ± 625,7 specie, mentre Sourmash ne ha trovate solo 192 ± 48,69.

Gli autori suggeriscono che queste differenze non siano solo rumore casuale, ma siano guidate dalla logica interna degli strumenti. Ad esempio, Kraken2 è come un bibliotecario che dice: "Se vedo anche un solo piccolo indizio, inserirò quel nome nella lista", mentre Sourmash è più severo, dicendo: "Ho bisogno di un intero mucchio di prove prima di aggiungere un nome alla lista".

La Biblioteca Conta

Non è solo il bibliotecario; è anche la biblioteca che sta usando. L'articolo ha testato due enormi database di riferimento: RefSeq (basato sulla tassonomia NCBI) e GTDB (basato sulle relazioni filogenomiche).

• La libreria GTDB era molto più grande, contenendo oltre 113.104 specie, rispetto alle 27.285 di RefSeq.
• Naturalmente, usando la libreria più grande (GTDB), si è riscontrata una diversità maggiore. L'articolo nota che se si usa GTDB, lo strumento potrebbe raggruppare i batteri Shigella sotto E. coli, cambiando l'intera struttura della lista degli ospiti.

Il Momento del "E quindi?": Le Conclusioni Cambiano?

Questa è la parte più critica della storia. Importa se le liste degli ospiti sono diverse? Sì, a volte.

Quando i ricercatori hanno chiesto: "La diversità è diversa tra persone sane e malate?", la risposta dipendeva interamente dallo strumento utilizzato.

• Nel dataset Gut PD (malattia di Parkinson) con 719 campioni, la differenza tra i gruppi era statisticamente significativa per 9 su 13 metodologie. Ma la "forza" di quella differenza (la dimensione dell'effetto) variava enormemente, da 0,04 a 0,13.
• Nel dataset Gut NAFLD, solo una specifica configurazione (Kraken con RefSeq a un alto livello di confidenza) ha trovato una differenza significativa, mentre gli altri hanno detto: "No, qui non c'è nulla".
• L'articolo sostiene esplicitamente che l'idea che tutti questi strumenti siano intercambiabili sia errata. Dimostrano che l'analisi della diversità alfa può essere guidata dalle scelte metodologiche, il che significa che un ricercatore potrebbe accidentalmente (o intenzionalmente) scegliere uno strumento che fa apparire la sua ipotesi vera o falsa.

La Buona Notizia: La Diversità Beta è Più Stabile

Mentre il "conteggio" degli ospiti (diversità alfa) era incerto, la "disposizione" degli ospiti (diversità beta) era più stabile. La diversità beta chiede: "Gli ospiti del Gruppo A sembrano diversi dagli ospiti del Gruppo B?".

• Gli autori hanno scoperto che, sebbene i numeri specifici cambiassero, le conclusioni statistiche sul fatto che i gruppi fossero diversi rimanevano generalmente le stesse.
• Ad esempio, nel dataset Gut RA (artrite reumatoide), la maggior parte degli strumenti concordava sul fatto che i gruppi fossero distinti, anche se discordavano esattamente su quanti tipi di specie fossero presenti.
• Tuttavia, l'articolo nota che l'uso del database RefSeq con Kraken portava talvolta a risultati diversi rispetto all'uso di GTDB, suggerendo che una libreria più grande e completa possa aiutare gli strumenti a concordare meglio sulla visione d'insieme.

Il Punto Chiave

Gli autori concludono che non esiste un unico strumento "migliore" che funzioni per tutto. La scelta "giusta" dipende dalla tua domanda specifica, dal tipo di campione e dalla libreria a cui hai accesso.

Avvertono i ricercatori contro il "cherry-picking" di uno strumento solo perché fornisce il risultato desiderato. Invece, suggeriscono di:

1. Essere trasparenti: Dichiarare chiaramente quale strumento, database e impostazioni sono stati utilizzati.
2. Controllare il proprio lavoro: Eseguire un' "analisi di sensibilità" per vedere se la conclusione principale regge anche se si scambia lo strumento o il database.
3. Non confrontare mele con arance: Non si può confrontare direttamente un numero di diversità da uno studio che usa lo Strumento A con uno studio che usa lo Strumento B, perché i numeri stessi sono influenzati dal software.

In breve, l'articolo suggerisce che, sebbene questi strumenti siano potenti, non sono bacchette magiche. Sono lenti, e lenti diverse possono mostrare versioni diverse dello stesso mondo microscopico. Per ottenere l'immagine più fedele, gli scienziati devono sapere esattamente attraverso quale lente stanno guardando.