Taxonomic profilers and their influence on metagenomic diversity analyses

당신이 미스터리를 해결하려는 탐정이라고 상상해 보세요. "이 작고 보이지 않는 도시에는 누가 살고 있는가?" 미생물 연구의 세계에서 그 도시는 흙, 타액, 또는 대변의 샘-플이며, 그 거주자들은 수십억 마리의 아주 작은 미생물들입니다. 그곳에 누가 사는지 알아내기 위해 과학자들은 **분류학적 프로파일러(taxonomic profilers)**라고 불리는 특별한 소프트웨어 도구들을 사용합니다. 이 도구들은 초고속 사서처럼 행동하며, 수백만 개의 DNA "페이지"를 스캔하고 이를 알려진 미생물의 거대한 참조 도서관과 대조하여 손님 목록을 만듭니다.

하지만 반전이 있습니다. 서로 다른 사서들이 각기 다른 카탈로그를 사용하거나 무엇을 "손님"으로 간주할지에 대한 서로 다른 규칙을 가질 수 있는 것처럼, 이 소프트웨어 도구들은 항상 손님 목록에 대해 일치하지는 않습니다. Jonathan Rondeau-Leclaire와 동료들이 이끈 이 논문은 가장 인기 있는 네 가지 "사서"(mOTUs, MetaPhlAn, Kraken2, Sourstop)를 테스트하기로 했습니다. 그들은 단순히 가짜로 만들어진 데이터를 본 것이 아니라, 인간의 장과 피부부터 이끼와 벌의 장에 이르기까지 8가지 데이터셋에서 추출한 1,211개의 실제 메타게놈을 깊이 파고들었습니다.

거대한 손님 목록의 불일치

연구팀은 선택한 사서에 따라 이야기가 크게 달라진다는 것을 발견했습니다. 만약 당신이 한 도구에게 손님의 수를 세라고 요청한다면, 그 도구는 "와, 500종의 서로 다른 종이 있네요!"라고 말할 수도 있습니다. 하지만 다른 도구에게 물어보면, 그 도구는 "사실, 제가 보기엔 200종뿐입니다"라고 말할 수도 있습니다.

논문은 알파 다양성(alpha diversity, 방 안에 얼마나 다양한 종류의 손님이 있고 그들이 얼마나 고르게 퍼져 있는지를 나타내는 멋진 표현)이 어떤 도구를 선택하느냐에 따라 매우 민감하다는 것을 발견했습니다.

• "DNA-대-마커" 사서들: MetaPhlAn과 mOTUs 같은 도구들은 미생물의 특정 "이름표"(마커 유전자)를 찾습니다. 동일한 유형의 라이브러리를 사용할 때도, 이 두 도구는 서로 다른 다양성 수치를 나타냈습니다. 예를 들어, 섀넌 다양성(Shannon diversity)을 살펴볼 때 mOTUs4는 MetaPhlAn4보다 더 높은 다양성을 발견했습니다.
• "DNA-대-DNA" 사서들: Kraken2와 Sourmash는 전체 DNA 서열을 비교하며, 마치 문단 전체를 맞추는 것과 같습니다. 이들은 훨씬 더 큰 변동을 보여주었습니다. 동일한 데이터베이스를 사용할 때, Kraken2는 종종 Sourmash보다 훨씬 더 많은 종을 보고했습니다. 실제로 특정 설정을 사용했을 때, Kraken2는 평균 1,167 ± 625.7종을 찾아낸 반면, Sourmash는 단 192 ± 48.69종만을 찾아냈습니다.

저자들은 이러한 차이가 단순한 무작위 노이즈가 아니라, 도구들의 내부 로직에 의해 발생한다고 제안합니다. 예를 들어, Kraken2는 "단 하나의 작은 단서라도 발견되면 그 손님을 목록에 올리겠다"라고 말하는 사서와 같고, Sourstop은 "목록에 이름을 올리기 위해서는 전체적인 증거 뭉치가 필요하다"라고 말하는 더 엄격한 사서와 같습니다.

도서관도 중요하다

사서뿐만 아니라 그들이 사용하는 도서관도 중요합니다. 논문은 두 가지 거대한 참조 데이터베이스를 테스트했습니다: RefSeq(NCBI 분류 체계 기반)와 GTDB(계통유전학적 관계 기반).

• GTDB 라이브ка는 113,104종 이상의 종을 포함하고 있어 RefSeq보다 훨씬 컸습니다 (RefSeq은 27,285종).
• 당연하게도, 더 큰 라이브러리(GTDB)를 사용하는 것이 더 많은 다양성을 발견하는 결과로 이어졌습니다. 논문은 만약 GTDB를 사용하면, 도구가 Shigella 박테리아를 E. coli 아래로 그룹화하여 전체적인 손님 목록의 구조를 바꿀 수 있다고 언급합니다.

"그래서 뭐?"의 순간: 결론이 바뀌는가?

여기서 가장 중요한 부분입니다. 손님 목록이 다르다는 것이 정말 문제가 될까요? 네, 때때로 그렇습니다.

연구자들이 "환자와 건강한 사람 사이의 다양성이 다른가?"라고 물었을 때, 그 답은 전적으로 어떤 도구를 사용했는지에 달려 있었습니다.

• 719개의 샘플이 있는 Gut PD(파킨슨병) 데이터셋의 경우, 그룹 간의 차이는 13가지 방법론 중 9가지에서 통계적으로 유n의미했습니다. 하지만 그 차이의 "강도"(효과 크기)는 0.04에서 0.13까지 매우 다양했습니다.
• Gut NAFLD 데이터셋에서는 오직 한 가지 특정 설정(높은 신뢰 수준에서의 Kraken과 RefSeq 조합)만이 유의미한 차이를 발견한 반면, 나머지들은 "아니요, 여기엔 아무것도 없습니다"라고 답했습니다.
• 이 논문은 이러한 도구들이 서로 대체 가능하다는 생각에 명시적으로 반대합니다. 저자들은 알파 다양성 분석이 방법론적 선택에 의해 좌우될 수 있음을 보여주며, 이는 연구자가 의도적으로 혹은 실수로 자신의 가설이 참인 것처럼 보이게 하거나 거짓인 것처럼 보이게 하는 도구를 선택할 수 있음을 의미합니다.

좋은 소식: 베타 다양성은 더 안정적이다

손님의 "수"(알파 다양성)는 불안정했지만, 손님들의 "배치"(베타 다양성)는 더 안정적이었습니다. 베타 다양성은 "그룹 A의 손님들과 그룹 B의 손님들이 서로 다르게 보이는가?"를 묻습니다.

• 저자들은 구체적인 숫자는 변할지라도, 그룹들이 서로 다르다는 것에 대한 통계적 결론은 대개 동일하게 유지된다는 것을 발견했습니다.
• 예를 들어, Gut RA(류마티스 관절염) 데이터셋에서 대부분의 도구는 정확히 몇 종이 존재하는지에 대해서는 의견이 달랐을지라도, 그룹들이 구별된다는 점에는 동의했습니다.
• 그러나 논문은 RefSeq 데이터베이스를 사용하는 Kraken이 때때로 GTDB를 사용하는 것과 다른 결과를 초래할 수 있다고 언급하며, 더 크고 완전한 라이브러리가 도구들이 큰 그림에서 더 잘 합의하도록 도울 수 있음을 시사했습니다.

핵심 요약

저자들은 모든 것에 적합한 단 하나의 "최고" 도구는 없다고 결론짓습니다. "올바른" 선택은 당신의 구체적인 질문, 샘플 유형, 그리고 당신이 접근할 수 있는 라이브러리에 달려 있습니다.

그들은 연구자들이 단지 자신이 원하는 결과를 주는 도구를 골라 쓰는 "체리 피킹(cherry-picking)"을 경계하라고 경고합니다. 대신, 다음과 같이 제안합니다:

1. 투명해지세요: 어떤 도구, 데이터베이스, 설정을 사용했는지 명확하게 밝히십시오.
2. 검증하세요: 도구나 데이터베이스를 바꿨을 때도 당신의 주요 결론이 유지되는지 확인하는 "민감도 분석(sensitivity analysis)"을 수행하십시오.
3. 사과와 오렌지를 비교하지 마세요: 도구 A를 사용한 연구의 다양성 수치를 도구 B를 사용한 연구의 수치와 직접 비교할 수 없습니다. 왜냐นั้น 숫자 자체가 소프트웨어의 영향을 받기 때문입니다.

요약하자면, 이 논문은 이러한 도구들이 강력하긴 하지만 마법 지팡이는 아니라고 제사합니다. 그것들은 렌즈이며, 서로 다른 렌즈는 동일한 미세 세계에 대해 서로 다른 버전을 보여줄 수 있습니다. 가장 진실한 그림을 얻기 위해서, 과학자들은 자신이 정확히 어떤 렌즈를 통해 보고 있는지 알아야 합니다.