Taxonomic profilers and their influence on metagenomic diversity analyses

Imaginez que vous soyez un détective tentant de résoudre un mystère : « Qui vit dans cette minuscule ville invisible ? » Dans le monde de la recherche sur le microbiome, cette ville est un échantillon de terre, de salive ou de selles, et ses résidents sont des milliards de minuscules microbes. Pour découvrir qui y vit, les scientifiques utilisent des outils logiciels spéciaux appelés profilers taxonomiques. Ces outils agissent comme des bibliothécaires super rapides, scannant des millions de « pages » d'ADN et les faisant correspondre à une immense bibliothèque de référence de microbes connus pour établir une liste d'invités.

Mais voici le rebondissement : tout comme différents bibliothécaires pourraient utiliser des catalogues différents ou avoir des règles différentes sur ce qui compte comme un « invité », ces outils logiciels ne sont pas toujours d'accord sur la liste des invités. Cet article, dirigé par Jonathan Rondeau-Leclaire et ses collègues, a décidé de mettre à l'épreuve quatre des « bibliothécaires » les plus populaires (mOTUs, MetaPhlAn, Kraken2 et Sourmash). Ils ne se sont pas contentés d'examiner des données fictives et inventées ; ils ont fouillé dans 1 211 métagénomes réels provenant de huit ensembles de données différents, allant des intestins et de la peau humains à la mousse et aux intestins d'abeilles.

Le grand écart des listes d'invités

L'équipe a découvert que le choix du bibliothécaire change considérablement l'histoire. Si vous demandez à un outil de compter les invités, il pourrait dire : « Wow, il y a 500 espèces différentes ! » Demandez à un autre outil, et il pourrait dire : « En fait, je n'en vois que 200. »

L'article a découvert que l'alpha diversité (une façon sophistiquée de dire « combien de types d'invités différents sont dans la pièce et comment ils sont répartis de manière égale ») est extrêmement sensible à l'outil que vous choisissez.

• Les bibliothécaires « ADN-vers-marqueurs » : Les outils comme MetaPhlAn et mOTUs cherchent des « étiquettes de nom » spécifiques (gènes marqueurs) sur les microbes. Même en utilisant le même type de bibliothèque, ces deux outils ont donné des comptes de diversité différents. Par exemple, mOTUs4 a trouvé une diversité plus élevée que MetaPhlAn4 dans 95,5 % des échantillons lors de l'examen de la diversité de Shannon.
• Les bibliothécaires « ADN-vers-ADN » : Les outils comme Kraken2 et Sourmash comparent la séquence d'ADN entière, comme s'ils faisaient correspondre des paragraphes entiers. Ceux-ci ont montré des variations encore plus sauvages. En utilisant la même base de données, Kraken2 rapportait souvent beaucoup plus d'espèces que Sourmash. En fait, avec un paramètre spécifique, Kraken2 a trouvé une moyenne de 1 167 ± 625,7 espèces, tandis que Sourmath en a trouvé seulement 192 ± 48,69.

Les auteurs suggèrent que ces différences ne sont pas de simples bruits aléatoires ; elles sont dictées par la logique interne des outils. Par exemple, Kraken2 est comme un bibliothécaire qui dit : « Si je vois ne serait-ce qu'un petit indice, je liste cet invité », tandis que Sourmash est plus strict, disant : « Il me faut un tas de preuves avant d'ajouter un nom sur la liste. »

La bibliothèque compte aussi

Ce n'est pas seulement le bibliothécaire qui importe, c'est aussi la bibliothèque qu'il utilise. L'article a testé deux bases de données de référence massives : RefSeq (basée sur la taxonomie de l'NCBI) et GTDB (basée sur les relations phylogénomiques).

• La bibliothèque GTDB était beaucoup plus grande, contenant plus de 113 104 espèces, contre 27 285 pour RefSeq.
• Naturellement, l'utilisation de la plus grande bibliothèque (GTDB) a permis de trouver plus de diversité. L'article note que si vous utilisez GTDB, l'outil peut regrouper les bactéries Shigella sous E. coli, modifiant ainsi toute la structure de la liste des invités.

Le moment crucial : Les conclusions changent-elles ?

Voici la partie la plus critique de l'histoire. Est-ce que cela importe si les listes d'invités sont différentes ? Oui, parfois.

Lorsque les chercheurs ont demandé : « La diversité est-elle différente entre les personnes malades et les personnes saines ? », la réponse dépendait entièrement de l'outil utilisé.

• Dans l'ensemble de données Gut PD (maladie de Parkinson) avec 719 échantillons, la différence entre les groupes était statistiquement significative pour 9 méthodologies sur 13. Mais la « force » de cette différence (la taille de l'effet) variait énormement, allant de 0,04 à 0,13.
• Dans l'ensemble de données Gut NAFLD, une seule configuration spécifique (Kraken avec RefSeq à un niveau de confiance élevé) a trouvé une différence significative, tandis que les autres ont répondu : « Non, rien ici. »
• L'article soutient explicitement l'idée que tous ces outils ne sont pas interchangeables. Ils montrent que l'analyse de l'alpha diversité peut être pilotée par des choix méthodologiques, ce qui signifie qu'un chercheur pourrait accidentellement (ou intentionnellement) choisir un outil qui fait paraître son hypothèse vraie ou fausse.

La bonne nouvelle : La bêta diversité est plus stable

Bien que le « compte » des invités (alpha diversité) soit instable, l'« arrangement » des invités (bêta diversité) est plus stable. La bêta diversité demande : « Est-ce que les invités du Groupe A ressemblent aux invités du Groupe B ? »

• Les auteurs ont trouvé que même si les chiffres spécifiques changeaient, les conclusions statistiques sur le fait que les groupes étaient différents restaient généralement les mêmes.
• Par exemple, dans l'ensemble de données Gut RA (polyarthrite rhumatoïde), la plupart des outils étaient d'accord sur le fait que les groupes étaient distincts, même s'ils n'étaient pas d'accord sur le nombre exact d'espèces présentes.
• Cependant, l'article note que l'utilisation de la base de données RefSeq avec Kraken a parfois conduit à des résultats différents de l'utilisation de GTDB, suggérant qu'une bibliothèque plus grande et plus complète pourrait aider les outils à mieux s'accorder sur la vue d'ensemble.

À retenir

Les auteurs concluent qu'il n'existe pas d'outil unique « meilleur » qui fonctionne pour tout. Le « bon » choix dépend de votre question spécifique, de votre type d'échantillon et de la bibliothèque à laquelle vous avez accès.

Ils mettent en garde les chercheurs contre le « cherry-picking » (le choix sélectif) d'un outil simplement parce qu'il donne le résultat qu'ils souhaitent. Au lieu de cela, ils suggèrent de :

1. Être transparent : Indiquez clairement quel outil, quelle base de données et quels paramètres vous avez utilisés.
2. Vérifier votre travail : Effectuez une « analyse de sensibilité » pour voir si votre conclusion principale tient toujours si vous changez d'outil ou de base de données.
3. Ne pas comparer des pommes avec des oranges : Vous ne pouvez pas comparer directement un chiffre de diversité provenant d'une étude utilisant l'Outil A avec un chiffre d'une étude utilisant l'Outil B, car les chiffres eux-mêmes sont influencés par le logiciel.

En résumé, l'article suggère que bien que ces outils soient puissants, ils ne sont pas des baguettes magiques. Ce sont des lentilles, et différentes lentilles peuvent montrer différentes versions du même monde microscopique. Pour obtenir l'image la plus fidèle, les scientifiques doivent savoir exactement à travers quelle lentille ils regardent.