Optimized cryo-FIB milling strategy to generate thin, minimally damaged biological lamellae

Sintesi Tecnica: Strategia di fresatura Cryo-FIB ottimizzata per lamelle biologiche sottili e minimamente danneggiate

Il Problema
La tomografia elettronica criogenica (cryo-ET) è uno strumento potente per visualizzare le macromolecole nel loro ambiente cellulare nativo. Tuttavia, la maggior parte delle cellule è troppo spessa per l'imaging diretto, rendendo necessaria l'assottigliamento dei campali congelati in lamelle tramite fresatura con fascio ionico focalizzato criogenico (cryo-FIB). Sebbene la fresatura FIB preservi meglio l'ultrastruttura rispetto all'ultramicrotomia criogenica tradizionale, essa introduce un significativo danno da radiazione che decade esponenzialmente dalla superficie, rilevabile fino a 40–60 nm di profondità. Questo danno crea un compromesso: le lamelle più spesse soffrono di un ridotto rapporto segnale-rumore (SNR) dovuto allo scattering degli elettroni, mentre le lamelle più sottili soffrono di un danno da FIB dominante. Di conseguenza, i protocolli standard che utilizzano fasci di gallio a 30 kV producono tipicamente risultati ottimali a circa 90–100 nm di spessore, limitando la risoluzione delle strutture in situ e impedendo la rilevazione di complessi macromolecolari più piccoli o meno abbondanti. Gli attuali metodi non riescono a produrre lamelle con regioni inferiori ai 100 nm che rimangano indenni, ponendo di fatto un limite alle informazioni recuperabili dalle sezioni cellulari.

Metodologia
Gli autori presentano Nilas, una strategia di fresatura a bassa energia progettata per minimizzare il danno da FIB e generare lamelle sottili. Il protocollo sfrutta il principio secondo cui la riduzione della tensione di accelerazione riduce la profondità di impianto ionico e la generazione di elettroni secondari. Il flusso di lavoro Nilas prevede una riduzione della tensione in tre fasi:

1. Fresatura Grossolana (30 kV): Fresatura standard per creare la forma della lamella, utilizzando sovra- e sotto-inclinazioni (±1.5°) e un aumento della deposizione di organo-platino per proteggere la superficie e prevenire la rottura.
2. Fresatura Media (8 kV): Un passaggio a 8 kV per ridurre il danno, utilizzando un'inclinazione leggera (±0.5°) e una maggiore distanza tra la sezione di pulizia e la lamella per accomodare il fascio più ampio.
3. Lucidatura Finale (2 kV): Una fase critica a basso voltaggio che utilizza un fascio di gallio a 2 kV con un'alta inclinazione (±10° di sovra- e sotto-inclinazione). Questo approccio ad alto angolo compensa il fascio meno focalizzato alle basse tensioni, permettendo la rimozione dello strato di danno del precedente passaggio a 8 kV e lucidando un'ampia area (4–7 µm) a uno spessore sub-50 nm.

Gli autori hanno utilizzato il template matching bidimensionale (2DTM) su micrografie non inclinate come un saggio sensibile a singola molecola per quantificare il danno. Misurando lo z-score 2DTM delle grandi subunità ribosomiali (LSU) in funzione della profondità dalla superficie della lamella, hanno stabilito una metrica per l'integrità delle particelle. Questo saggio è stato utilizzato per confrontare le lamelle fresate con Nilas rispetto ai controlli fresati con 30 kV.

Contributi Chiave e Risultati

• Riduzione dello Strato di Danno: Le lamelle fresate con Nilas esibiscono un danno da FIB minimo, con un danno rilevabile limitato a circa 20 nm dalla superficie, rispetto alla profondità di danno di 50–60 nm osservata nei campioni fresati a 30 kV. Gli z-score 2DTM per i ribosomi nelle lamelle Nilas sono significativamente più alti, in particolare nelle regioni più sottili di 100 nm.
• Generazione di Lamelle Ultra-sottili: Il protocollo produce costantemente lamelle con regioni a o sotto i 50 nm di spessore, un traguardo non raggiunto con la lucidatura standard a 30 kV. Queste regioni sottili mostrano un visibile aumento del contrasto e dell'SNR.
• Miglioramento delle Ricostruzioni 3D: Le ricostruzioni 3D delle subunità ribosomiali da lamelle fresate con Nilas hanno raggiunto una risoluzione globale e locale superiore (4.94 Å vs 5.93 Å per 30 kV) con meno particelle. Il fattore B di Rosenthal-Henderson era significativamente più basso (51 Ų vs 81 Ų), indicando un minor danno e una migliore fedeltà strutturale. Notevolmente, la densità coerente con il tRNA, assente nel template, è stata risolta nelle ricostruzioni Nilas ma non nei controlli a 30 kV.
• Estensione dei Limiti di Rilevazione: Il miglioramento dell'SNR e la riduzione del danno hanno abbassato la massa molecolare minima rilevabile prevista per il 2DTM da 340 kDa (30 kV) a **220 kDa** (Nilas).
• Recupero di Diversi Complessi: Oltre ai ribosomi, Nilas ha permesso la rilevazione di vari complessi non ribosomiali difficili da identificare con i protocolli standard:
  • Piccole Subunità Ribosomiali (SSU): Il recupero è aumentato a circa il 65% dei conteggi delle LSU nelle sezioni sottili.
  • Proteasoma 20S (702 kDa): Rilevato con z-score più elevati nelle regioni nucleari.
  • Fosfofruttochinasi (617 kDa): Il recupero è stato circa 5.5 volte superiore nelle lamelle Nilas.
  • RNA Polimerasi III (528 kDa): Mappata con successo nel nucleo di lievito, un complesso precedentemente difficile da identificare in situ.
  • Piruvato Chinasi (198 kDa): Nonostante sia al di sotto del limite teorico di rilevazione, sono state recuperate rilevazioni significative in Nilas grazie all'alta abbondanza, mentre nessuna è stata trovata nei campioni a 30 kV.

Significato
L'articolo sostiene che Nilas porti la "proteomica visiva" più vicina alla realtà, estendendo il limite dimensionale della biologia strutturale in situ. Decoupling (disaccoppiando) il compromesso tra spessore del campione e danno da fascio ionico, Nilas massimizza l'SNR disponibile dalle sezioni cellulari. Ciò consente l'annotazione di una gamma più ampia del proteoma, inclusi i complessi più piccoli e meno abbondanti, e facilita la determinazione di strutture ad alta risoluzione direttamente nel contesto cellulare. Gli autori sottolineano che il metodo è compatibile con l'hardware comune per FIB a gallio (es. Aquilos, Crossbeam), rendendolo accessibile a una vasta base di utenti senza richiedere sistemi specializzati a FIB a plasma. Sebbene gli autori riconoscano limitazioni come la maggiore fragilità delle lamelle ultra-sottili e la presenza di un fine "curtaining", essi sostengono che i guadagni nel recupero del segnale e la capacità di immagini <50 nm rappresentino un significativo avanzamento rispetto agli attuali protocolli di fresatura standard.