Optimized cryo-FIB milling strategy to generate thin, minimally damaged biological lamellae

Resumo Técnico: Estratégia de Fresagem Cryo-FIB Otimizada para Lamelas Biológicas Finas e Minimamente Danificadas

O Problema
A criotomia eletrônica (cryo-ET) é uma ferramenta poderosa para visualizar macromoléculas em seu ambiente celular nativo. No entanto, a maioria das células é espessa demais para imagem direta, necessitando o afinamento de amostras congeladas em lamelas via fresagem por feixe de íons focados criogênicos (cryo-FIB). Embora a fresagem por FIB preserve melhor a ultraestrutura do que a ultramicrotomia criogênica tradicional, ela introduz danos significativos por radiação que decaem exponencialmente da superfície, detectáveis até 40–60 nm de profundidade. Esse dano cria um compromisso (trade-off): lamelas mais espessas sofrem de redução na relação sinal-ruído (SNR) devido ao espalhamento de elétrons, enquanto lamelas mais finas sofrem com o dano dominante induzido pelo FIB. Consequentemente, protocolos padrão utilizando feixes de íons de gálio de 30 kV tipicamente produzem resultados ótimos em aproximadamente 90–100 nm de espessura, limitando a resolução de estruturas in situ e impedindo a detecção de complexos macromoleculares menores ou menos abundantes. Os métodos atuais falham em produzir lamelas com regiões inferiores a 100 nm de espessura que permaneçam sem danos, o que limita a informação recuperável de seções celulares.

Metodologia
Os autores apresentam o Nilas, uma estratégia de fresagem de baixa energia projetada para minimizar o dano por FIB e gerar lamelas finas. O protocolo utiliza o princípio de que a redução da voltagem de aceleração reduz a profundidade da implantação de íons e a geração de elétrons secundários. O fluxo de trabalho Nilas envolve uma redução de voltagem em três etapas:

1. Fresagem Grossa (30 kV): Fresagem padrão para criar a forma da lamela, utilizando sobre-inclinação e sub-inclinação (±1.5°) e aumento da deposição de organo-platina para proteger a superfície e evitar quebras.
2. Fresagem Média (8 kV): Uma redução para 8 kV para reduzir o dano, utilizando uma leve inclinação (±0.5°) e maior distância entre a seção de limpeza e a lamela para acomodar o feixe mais largo.
3. Polimento Final (2 kV): Uma etapa crítica de baixa voltagem usando um feixe de gálio de 2 kV com uma alta inclinação (±10° de sobre-inclinação e sub-inclinação). Essa abordagem de alto ângulo compensa o feixe menos focado em baixas voltagens, permitindo a remoção da camada de dano da etapa anterior de 8 kV enquanto polimenta uma grande área (4–7 µm) para uma espessura sub-50 nm.

Os autores utilizaram o pareamento de modelos bidimensionais (2DTM) em micrografias sem inclinação como um ensaio sensível de molécula única para quantificar o dano. Ao medir o z-score de 2DTM de subunidades ribossomais grandes (LSU) como uma função da profundidade em relação à superfície da lamela, eles estabeleceram uma métrica para a integridade das partículas. Este ensaio foi usado para comparar as lamelas fresadas por Nilas contra controles fresados por 30 kV padrão.

Principais Contribuições e Resultados

• Redução da Camada de Dano: As lamelas fresadas por Nilas exibem dano mínimo por FIB, com dano detectável limitado a cerca de ~20 nm da superfície, comparado à profundidade de dano de 50–60 nm observada em amostras fresadas a 30 kV. Os z-scores de 2DTM para ribossomos em lamelas Nilas são significativamente mais altos, particularmente em regiões com menos de 100 nm.
• Geração de Lamelas Ultra-finas: O protocolo produz consistentemente lamelas com regiões em ou abaixo de 50 nm de espessura, um feito não alcançado pela fresagem de 30 kV padrão. Essas regiões finas mostram um aumento visível no contraste e na SNR.
• Melhores Reconstruções 3D: Reconstruções 3D de subunidades ribossomais de lamelas fresadas por Nilas alcançaram maior resolução global e local (4.94 Å vs. 5.93 Å para 30 kV) com menos partículas. O fator B de Rosenthal-Henderson foi significativamente menor (51 Ų vs. 81 Ų), indicando menor dano e melhor fidelidade estrutural. Notavelmente, a densidade consistente com tRNA, ausente no modelo, foi resolvida nas reconstruções Nilas, mas não nos controles de 30 kV.
• Extensão dos Limites de Detecção: A melhoria na SNR e a redução do dano baixaram o limite mínimo de massa molecular detectável previsto para 2DTM de 340 kDa (30 kV) para **220 kDa** (Nilas).
• Recuperação de Complexos Diversos: Além dos ribossomos, o Nilas permitiu a detecção de vários complexos não ribossomais que são difíceis de identificar com protocolos padrão:
  • Subunidades Ribossomais Pequenas (SSU): A recuperação aumentou para ~65% das contagens de LSU em seções finas.
  • Proteassoma 20S (702 kDa): Detectado com z-scores mais altos em regiões nucleares.
  • Fosfofrutocinase (617 kDa): A recuperação foi ~5.5x maior em lamelas Nilas.
  • RNA Polimerase III (528 kDa): Mapeada com sucesso no núcleo de levedura, um complexo anteriormente difícil de identificar in situ.
  • Piruvato Quinase (198 kDa): Apesar de estar abaixo do limite teórico de detecção, detecções significativas foram recuperadas em lamelas Nilas devido à alta abundância, enquanto nenhuma foi encontrada em amostras de 30 kV.

Significância
O artigo afirma que o Nilas traz a "proteômica visual" mais próxima da realidade, estendendo o limite de tamanho para a biologia estrutural in situ. Ao desacoplar o compromisso entre a espessura da amostra e o dano por feixe de íons, o Nilas maximiza a SNR disponível de seções celulares. Isso permite a anotação de uma gama mais ampla do proteoma, incluindo complexos menores e menos abundantes, e facilita a determinação de estruturas de maior resolução diretamente no contexto celular. Os autores enfatizam que o método é compatível com o hardware comum de FIB de gálio (ex: Aquilos, Crossbeam), tornando-o acessível a uma base de usuários diversificada sem exigir sistemas especializados de plasma FIB. Embora os autores reconheçam limitações, como o aumento da fragilidade de lamelas ultra-finas e a presença de cortinas finas (curtaining), eles sustentam que os ganhos em recuperação de sinal e a capacidade de imaginar regiões <50 nm representam um avanço significativo sobre os protocolos de fresagem padrão atuais.