Optimized cryo-FIB milling strategy to generate thin, minimally damaged biological lamellae

기술 요약: 얇고 손상이 최소화된 생물학적 라멜라를 위한 최적화된 Cryo-FIB 밀링 전략

문제점
저온 전자 단층 촬영(cryo-ET)은 천연 세포 환경 내의 거대 분자를 시각화하는 강력한 도구이다. 그러나 대부분의 세포는 직접 이미징하기에는 너무 두꺼워, cryo-FIB(집속 이온 빔) 밀링을 통해 얇은 판상 구조인 라멜라(lamellae)로 얇게 만들어야 한다. FIB 밀링은 전통적인 cryo-ultramicrotomy보다 구조를 더 잘 보존하지만, 표면으로부터 지수 함수적으로 감소하는 상당한 방사선 손상을 유발하며, 이는 40–60 nm 깊이까지 감지된다. 이 손상은 하나의 트레이드오프를 만든다: 두꺼운 라멜라는 전자 산란으로 인해 신호 대 잡음비(SNR)가 낮아지는 반면, 얇은 라멜라는 FIB 유도 손상이 지배적이 된다. 결과적으로, 일반적으로 30 kV 갈륨 이온 빔을 사용하는 표준 프로토콜은 약 90–100 nm 두께에서 최적의 결과를 얻으며, 이는 in situ 구조의 해상도를 제한하고 더 작거나 덜 풍부한 거대 분자 복합체의 검출을 방해한다. 현재의 방법들은 손상되지 않은 상태로 100 nm 미만의 두께를 가진 라멜라를 생성하는 데 실패하며, 이는 세포 절편으로부터 회복 가능한 정보의 한계를 설정한다.

방법론
저자들은 FIB 손상을 최소화하고 얇은 라멜라를 생성하기 위해 설계된 저에너지 밀링 전략인 Nilas를 제시한다. 이 프로토콜은 가속 전압을 낮추면 이온 주입 및 이차 전자 생성의 깊이가 줄어든다는 원리를 활용한다. Nilas 워크플로우는 세 단계의 전압 감소 과정을 포함한다:

1. 거친 밀링 (Rough Milling, 30 kV): 라멜라의 형태를 만들기 위한 표준 밀링 단계로, 과잉 및 과소 틸트(±1.5°)를 사용하며 표면을 보호하고 파손을 방지하기 위해 증가된 organo-platinum 증착을 활용한다.
2. 중간 밀링 (Medium Milling, 8 kV): 손상을 줄이기 위해 8 kV로 전압을 낮추는 단계로, 약간의 틸트(±0.5°)를 사용하며 넓은 빔을 수용하기 위해 클리닝 단면과 라멜라 사이의 거리를 늘린다.
3. 최종 폴리싱 (Final Polish, 2 kV): 2 kV 갈륨 빔과 높은 틸트(±10° 과잉 및 과소 틸트)를 사용하는 핵심적인 저전압 단계이다. 이 고각 접근 방식은 저전압에서 초점이 덜 맞은 빔을 보완하여, 이전 8 kV 단계의 손상층을 제거하는 동시에 4–7 µm의 넓은 영역을 50 nm 미만의 두께로 폴리싱한다.

저자들은 손상 정도를 정량화하기 위한 민감한 단일 분자 분석법으로서, 기울어지지 않은 마이크로그래프(untilted micrographs)에 대한 **2차원 템플릿 매칭(2DTM)**을 활용하였다. 라멜라 표면으로부터의 깊이에 따른 대형 리보솜 소단위(LSU)의 2DTM z-score를 측정함으로써 입자 무결성에 대한 지표를 확립하였다. 이 분석법은 Nilas로 밀링된 라멜라를 표준 30 kV 밀링 대조군과 비교하는 데 사용되었다.

주요 기여 및 결과

• 손상층 감소: Nilas로 밀링된 라멜라는 검출 가능한 손상이 표면으로부터 약 20 nm 이내로 제한되어, 30 kV 밀링 샘플에서 관찰되는 50–60 nm의 손상 깊이에 비해 최소한의 FIB 손상을 보인다. 얇은 영역에서 Nil가를 사용한 리보좀의 2DTM z-score는 현저히 높다.
• 초박형 라멜라 생성: 이 프로토콜은 표준 30 kV 폴리싱으로는 달성할 수 없었던, 50 nm 또는 그 이하의 두께를 가진 영역을 일관되게 생성한다. 이러한 얇은 영역은 가시적인 대비와 SNR의 증가를 보여준다.
• 개선된 3D 재구성: Nilas 밀링된 라멜라로부터 얻은 리보솜 소단위의 3D 재구성은 더 적은 수의 입자로도 더 높은 전역 및 국부 해상도(4.94 Å vs. 5.93 Å)를 달성하였다. Rosenthal-Henderson B-factor는 현저히 낮아졌으며(51 Ų vs. 81 Ų), 이는 손상이 감소하고 구조적 충실도가 향상되었음을 나타낸다. 특히, 템플릿에는 존재하지 않았던 tRNA와 일치하는 밀도가 Nilas 재구성에서는 나타났으나 30 kV 대조군에서는 나타나지 않았다.
• 검출 한계 확장: 개선된 SNR과 감소된 손상은 2DTM의 예측 최소 검출 질량을 약 340 kDa(30 kV)에서 약 220 kDa(Nilas)로 낮추었다.
• 다양한 복합체 회복: 리보좀 외에도, Nilas는 표준 프로토콜로는 식별하기 어려운 다양한 비리보솜 복합체의 검출을 가능하게 했다:
  • 소형 리보솜 소단위 (SSU): 얇은 절편에서의 LSU 수 대비 회복률이 약 65%로 증가했다.
  • 20S 프로테아좀 (702 kDa): 핵 영역에서 더 높은 z-score와 함께 검출되었다.
  • 포스포프럭토키나아제 (617 kDa): Nilas 라멜라에서 회복률이 약 5.5배 더 높았다.
  • RNA 폴리머라아제 III (528 kDa): 기존에 식별하기 어려웠던 효모 핵 내의 복합체를 성공적으로 매핑하였다.
  • 피루베이트 키나아제 (198 kDa): 이론적 검출 한계 미만임에도 불구하고, 높은 풍부도 덕분에 Nilas 라멜라에서 유의미한 검출이 이루어졌으나, 30 kV 샘플에서는 하나도 발견되지 않았다.

의의
본 논문은 Nilas가 세포 내 구조 생물학의 크기 한계를 확장함으로써 "비주얼 프로테오믹스(visual proteomics)"를 현실에 더 가깝게 가져왔다고 주장한다. 샘플 두께와 이온 빔 손상 사이의 트레이드오프를 해소함으로써, Nilas는 세포 절편에서 사용 가능한 SNR을 극대화한다. 이를 통해 더 작은 혹은 덜 풍부한 복합체를 포함한 더 넓은 범위의 프로테옴을 주석화할 수 있으며, 세포 맥락 내에서 직접 더 높은 해상도의 구조를 결정하는 것을 용이하게 한다. 저자들은 이 방법이 일반적인 갈륨 FIB 하드웨어(예: Aquilos, Crossbeam)와 호환되어 특수한 플라즈마 FIB 시스템 없이도 다양한 사용자층이 접근 가능하다는 점을 강조한다. 저자들은 초박형 라멜라의 취약성 증가와 미세한 커테닝(curtaining) 현상을 한계점으로 인정하면서도, 신호 회복의 이점과 50 nm 미만 영역의 이미징 능력이 현재의 표준 밀링 프로토콜에 비해 중요한 진전임을 피력한다.