CRISPR/Cas9-mediated transformation enables functional characterization of the effector Avr4 in the banana pathogen Pseudocercospora fijiensis

Immaginate un mondo in cui un piccolo invasore invisibile sta lentamente divorando le scorte alimentari di milioni di persone. Questa non è la storia di un virus zombie o di un robot gigante; si tratta di un fungo chiamato Pseudocercospora fijiensis, il colpevole della "Malattia delle Strie Nere delle Foglie". Questo fungo attacca le piante di banana, trasformando le loro foglie verdi in un disastro necrotico e marrone. Poiché le banane sono un alimento base per centinaia di milioni di persone e una massiccia esportazione globale, questa malattia rappresenta un enorme problema. Attualmente, gli agricoltori combattono con una blitz chimico: spruzzando fungicidi fino a 70 volte l'anno. È costoso, dannoso per l'ambiente e insostenibile. L'unica vera soluzione a lungo termine è selezionare banane che siano naturalmente resistenti, ma per farlo, gli scienziati devono capire esattamente come funziona il fungo.

Il problema è che questo fungo è notoriamente difficile da studiare. È come cercare di riparare un orologio indossando pesanti guanti da saldatore; gli strumenti che gli scienziati usano di solito per toccare e stimolare i geni non funzionano bene qui. Il fungo cresce lentamente, è difficile da manipolare e i precedenti tentativi di modificare il suo DNA sono stati come lanciare freccette al buio: mancando quasi sempre il bersaglio. Tuttavia, un nuovo strumento è arrivato nella cassetta degli attrezzi scientifici: CRISPR/Cas9. Pensate a CRISPR come a un paio di forbici molecolari che possono essere programmate per tagliare un pezzo specifico di DNA con incredibile precisione. Se riuscite a tagliare il punto giusto, potete o rompere un gene per vedere cosa succede (un "knockout") o incollare una nuova istruzione. Ma per usare queste forbici, dovete prima farle entrare nella cella del fungo, che è protetta da un guscio esterno resistente. Questo articolo è la storia di come un team di scienziati abbia finalmente capito come rompere quel guscio, infilare le forbici all'interno e iniziare a modificare il codice del fungo della banana.

La svolta del fungo della banana: Tagliare il codice

Per molto tempo, il fungo della banana Pseudocercospora fijiensis è stato una "scatola nera" per gli scienziati. Sapevano che causava la Malattia delle Strie Nere delle Foglie, rovinando i raccolti e costringendo gli agricoltori a spruzzare costantemente sostanze chimiche tossiche, ma non riuscivano a capire facilmente come lo facesse. Il fungo è testardo; non ama crescere nei laboratori e le sue pareti cellulari sono così dure che far entrare gli strumenti genetici è stato quasi impossibile. Gli autori di questo articolo, guidati da Maikel Steentjes e colleghi, hanno deciso di costruire una nuova chiave per sbloccare questa scatola. Il loro obiettivo era creare un metodo affidabile per usare CRISPR/Cas9 — quelle forbici molecolari — per modificare i geni del fungo e vedere cosa succede quando parti specifiche vengono rotte.

Per prima cosa, il team doveva risolvere il "problema dell'ingresso". Per far entrare le forbici, dovevano trasformare il fungo in una cellula nuda, o "protoplasto", dissolvendo la sua dura parete esterna. Hanno trattato il fungo come una delicata torta, testando diverse ricette di enzimi (forbici biologiche che mangiano le pareti cellulari) per vedere quale miscela funzionasse meglio. Hanno scoperto che un cocktail specifico di quattro enzimi, applicato al fungo cresciuto in un brodo liquido per esattamente 40 ore, era la combinazione vincente. Questo processo era così efficiente che potevano trasformare il 96% delle loro cellule bersaglio in protoplasti senza ucciderle. Una volta che le cellule erano nude, hanno utilizzato un metodo chiamato trasformazione mediata da PEG, che è come dare alle cellule una leggera scossa elettrica per farle inghiottire il nuovo DNA. Hanno anche testato quali "tag antibiotici" (igromicina B e nourseotricina) il fungo avrebbe sopportato, assicurandosi di poter selezionare le modifiche andate a buon fine in seguito.

Con la porta aperta, il team ha testato le sue forbici CRISPR su tre geni diversi per vedere se il sistema funzionasse.

1. Il gene della melanina (PKS10-1): Questo gene è responsabile del rendere nero il fungo. Gli scienziati volevano vedere se potevano rendere il fungo giallo tagliando questo gene. Ha funzionato perfettamente. Su 23 tentativi, 22 hanno dato origine a colonie gialle, prive di melanina. Si tratta di un tasso di successo del 96%. Hanno persino dimostrato che si trattava del gene giusto rimettendolo e osservando il fungo tornare nero.
2. Il gene della crescita (Fus3): Questo gene aiuta il fungo a invadere le piante. Quando lo hanno tagliato, il fungo è cresciuto molto più lentamente e appariva strano. Circa il 58% dei tentativi ha interrotto con successo il gene.
3. Il gene "arma" (Avr4): Questo era il grande mistero. Studi precedenti suggerivano che Avr4 fosse una proteina speciale che il fungo usa per attaccare le banane, e che una varietà di banana resistente chiamata "Calcutta 4" potesse riconoscere questa proteina e reagire. Gli scienziati hanno usato il loro nuovo sistema CRISPR per eliminare completamente il gene Avr4.

Ecco dove la storia prende una piega. Quando gli scienziati hanno infettato banane normali e suscettibili (la varietà Cavendish) con il fungo a cui era stato eliminato il gene Avr4, il fungo ha causato sintomi di malattia altrettanto gravi rispetto al tipo selvatico, non mostrando alcuna riduzione della sua capacità di infezione. L' "arma" non era in realtà necessaria per vincere la battaglia. Ma la vera sorpresa è arrivata quando hanno testato le banane resistenti Calcutta 4. Anche senza il gene Avr4, il fungo non riusciva comunque a infettarle, e le piante hanno comunque lanciato una risposta di difesa.

Questo risultato esclude esplicitamente l'idea che Avr4 sia la ragione principale della resistenza della Calcutta 4. Gli autori dimostrano che la resistenza non è innescata dal fatto che il fungo mostri la sua bandiera Avr4; invece, la pianta deve riconoscere un'altra, sconosciuta "arma segreta" che il fungo sta ancora portando con sé. L'articolo suggerisce che la Calcutta 4 stia probabilmente monitorando un intero team di proteine fungine, non solo una.

L'articolo conclude che il loro nuovo sistema CRISPR è un vero punto di svolta. È altamente efficiente, permettendo agli scienziati di rompere i geni con alta precisione (fino al 96% di successo per alcuni target). Questo strumento rimuove la barriera principale allo studio di questo difficile fungo. Sebbene non abbiano trovato la "pallottola magica" per la resistenza nel gene Avr4, hanno dimostuto che il fungo ha altri trucchi nella manica. Ora che gli scienziati hanno un modo affidabile per tagliare e incollare il DNA del fungo, possono iniziare a dare la caccia a quegli altri effettori nascosti. Ciò apre la strada a comprendere finalmente la battaglia molecolare tra la banana e il fungo, che è il primo passo verso la selezione di banane che possano combattere da sole, salvando il raccolto dalla necessità di uno spruzzo costante di prodotti chimici.