CRISPR/Cas9-mediated transformation enables functional characterization of the effector Avr4 in the banana pathogen Pseudocercospora fijiensis

수백만 명의 식량 공급을 서서히 갉아먹는 작고 보이지 않는 침입자가 있는 세상을 상상해 보십시오. 이것은 좀비 바이러스나 거대 로봇에 관한 이야기가 아닙니다. 바로 "검은 잎 줄기 병(Black Leaf Streak Disease)"의 주범인 Pseudocercospora fijiensis라는 곰팡기에 관한 이야기입니다. 이 곰팡이는 바나나 나무를 공격하여 초록색 잎을 괴사한 갈색 덩어리로 만들어 버립니다. 바나나는 수억 명의 사람들에게 주식이며 거대한 글로벌 수출 품목이기 때문에, 이 질병은 매우 심각한 문제입니다. 현재 농부들은 화학적 공세로 맞서 싸우고 있습니다. 일 년에 무려 70번까지 살균제를 살포하는 방식입니다. 이는 비용이 많이 들고, 환경에 해로우며, 지속 불가능합니다. 유일한 실질적인 장기적 해결책은 자연적으로 저항력을 가진 바나나를 육종하는 것이지만, 이를 위해서는 과학자들이 이 곰팡이가 정확히 어떻게 작동하는지 이해해야 합니다.

문제는 이 곰팡기를 연구하기가 매우 까다롭다는 점입니다. 마치 두꺼운 용접 장갑을 끼고 시계를 수리하려는 것과 같습니다. 과학자들이 유전자를 찌르고 건드리기 위해 사용하는 일반적인 도구들이 여기서는 잘 작동하지 않습니다. 이 곰팡기는 성장이 느리고 조작하기 어려우며, 이전의 DNA 편집 시도들은 마치 목표물을 빗나가는 다트 던지기와 같았습니다. 대부분 빗나갔던 것이죠. 하지만 이제 과학자의 도구 상자에 새로운 도구가 도착했습니다. 바로 CRISPR/Cas9입니다. CRISPR를 특정 DNA 조각을 놀라운 정밀도로 자를 수 있도록 프로그래밍된 '분자 가위'라고 생각하십시오. 적절한 위치를 자를 수 있다면, 유전자를 파괴하여 어떤 일이 일어나는지 관찰하거나(노크아웃), 새로운 지침을 붙여넣을 수 있습니다. 하지만 이 가위를 사용하려면 먼저 단단한 외벽으로 보호받고 있는 곰팡이의 세포 안으로 가위를 집어넣어야 합니다. 이 논문은 과학자들이 마침내 어떻게 그 외벽을 허물고, 가위를 몰래 집어넣어, 바나나 곰팡기의 코드를 편집하기 시작했는지에 대한 이야기입니다.

바나나 곰팡기의 돌파구: 코드를 자르다

오랫동안 바나나 곰팡기인 Pseudocercospora fijiensis는 과학자들에게 "블랙박스"와 같았습니다. 그들은 이 곰팡기가 검은 잎 줄기 병을 일으켜 작물을 망치고 농부들이 끊임없이 독성 화학 물질을 뿌리게 만든다는 것은 알고 있었지만, 어떻게 그렇게 하는지는 쉽게 알아낼 수 없었습니다. 이 곰팡기는 고집스럽습니다. 실험실에서 키우기도 어렵고, 세포벽이 너무 단단해서 유전 도구를 내부로 넣는 것이 거의 불가능했습니다. Maikel Steentjes와 동료들이 이끄는 이 논문의 저자들은 이 상자를 열기 위한 새로운 열쇠를 만들기로 결しました. 그들의 목표는 CRISPR/Cas9—그 분자 가위—을 사용하여 곰팡기의 유전자를 편집하고 특정 부분이 파괴되었을 때 어떤 일이 일어나는지 확인하는 신뢰할 수 있는 방법을 만드는 것이었습니다.

먼저, 팀은 "진입 문제"를 해결해야 했습니다. 가위를 안으로 넣기 위해서는 효소를 사용하여 곰팡이의 단단한 외벽을 녹여 곰팡이를 알몸 세포, 즉 "프로토플라스트(protoplast)"로 만들어야 했습니다. 그들은 곰팡기를 섬세한 케이크처럼 취급하며, 어떤 혼합물이 가장 잘 작동하는지 보기 위해 다양한 효소(세포벽을 먹어 치우는 생물학적 가위)의 레시피를 테스트했습니다. 그들은 액체 배지에서 정확히 40시간 동안 배양된 곰팡이에 네 가지 효소로 구성된 특정 칵테일을 적용하는 것이 승리하는 조합임을 발견했습니다. 이 과정은 매우 효율적이어서, 대상 세포의 96%를 죽이지 않고도 프로토플라스트로 전환할 수 있었습니다. 세포가 알몸이 된 후, 그들은 세포가 새로운 DNA를 꿀꺽 삼키도록 부드러운 전기 충격을 주는 것과 같은 PEG 매개 형질도입법(PEG-mediated transformation)을 사용했습니다. 또한 곰팡이가 어떤 "항생제 태그"(hygromycin B 및 nourseothricin)에서 살아남을지 테스트하여, 나중에 성공적인 편집을 골라낼 수 있도록 했습니다.

문이 열리자, 팀은 시스템이 작동하는지 확인하기 위해 세 가지 다른 유전자에 대해 CRISPR 가위를 테스트했습니다.

1. 멜라닌 유전자 (PKS10-1): 이 유전자는 곰팡기를 검게 만드는 역할을 합니다. 과학자들은 이 유전자를 잘라내어 곰팡기를 노란색으로 만들 수 있는지 확인하고 싶었습니다. 결과는 완벽했습니다. 23번의 시도 중 22번이 멜라닌이 없는 노란색 군락을 만들어냈습니다. 이는 96%의 성공률입니다. 그들은 심지어 유전자를 다시 넣어 곰팡기가 다시 검게 변하는 것을 관찰함으로써 그것이 올바른 유전자임을 증명했습니다.
2. 성장 유전자 (Fus3): 이 유전자는 곰팡기가 식물에 침투하는 것을 돕습니다. 이 유전자를 자르자 곰팡이는 훨씬 느리게 자랐고 기형적인 모습을 보였습니다. 약 58%의 시도가 성공적으로 유전자를 파괴했습니다.
3. "무기" 유전자 (Avr4): 이것이 큰 미스터리였습니다. 이전 연구들은 Avr4가 곰팡이가 바나나를 공격하는 데 사용하는 특수한 단백질이며, "칼카타 4(Calcutta 4)"라고 불리는 저항성 바나나 품종이 이 단백질을 인식하여 맞서 싸울 것이라고 시사했습니다. 과학자들은 이 새로운 CRISPR 시스템을 사용하여 Avr4 유전자를 완전히 삭제했습니다.

여기서 이야기는 반전을 맞이합니다. 과학자들이 Avr4 유전자가 삭제된 곰팡기를 일반적인 감수성 바나나(캐번디시 품종)에 감염시켰을 때, 곰팡기는 야생형과 똑같이 심각한 질병 증상을 일으켰으며, 감염 능력에서도 감소를 보이지 않았습니다. 즉, "무기"는 전투에서 이기는 데 꼭 필요하지 않았던 것입니다. 하지만 진짜 놀라운 점은 저항성이 있는 칼카타 4 바나나를 테스트했을 때 나타났습니다. Avr4 유전자가 없어도 곰팡기는 여전히 그들을 감염시킬 수 없었으며, 식물은 여전히 방어 반응을 일으켰습니다.

이 발견은 Avr4가 칼카타 4의 저항성을 결정하는 주요 원인이라는 아이디어를 명시적으로 부정합니다. 저자들은 저항성이 곰팡기가 Avr4라는 깃발을 보여주기 때문에 발생하는 것이 아니라, 식물이 곰팡기가 여전히 가지고 있는 또 다른 미지의 "비밀 무기"를 인식하고 있음을 입증했습니다. 이 논문은 칼카타 4가 단 하나의 유전자가 아니라, 곰팡리의 전체 팀 단백질들을 주시하고 있을 가능성이 높다고 제안합니다.

이 논문은 그들의 새로운 CRISPR 시스템이 게임 체인저라고 결론짓습니다. 이 시스템은 매우 효율적이며, 과학자들이 높은 정밀도로(일부 표적에 대해 최대 96%의 성공률로) 유전자를 파괴할 수 있게 해줍니다. 이 도구는 이 까다로운 곰팡기를 연구하는 데 있어 가장 큰 장벽을 제거합니다. 비록 Avr4 유전자에서 "마법의 탄환"을 찾지는 못했지만, 그들은 곰팡기가 다른 속임수를 숨기고 있다는 것을 증명했습니다. 이제 과학자들은 곰팡기의 DNA를 자르고 붙일 수 있는 신뢰할 수 있는 방법을 갖게 되었으므로, 그 다른 숨겨진 이펙터(effector)들을 찾아 나서기 시작할 수 있습니다. 이는 바나나와 곰팡기 사이의 분자적 전투를 마침내 이해하는 문을 열어주며, 이는 바나나가 스스로 싸울 수 있도록 육종하여 지속적인 화학적 살포의 필요성으로부터 작물을 구하는 첫 단계입니다.