CRISPR/Cas9-mediated transformation enables functional characterization of the effector Avr4 in the banana pathogen Pseudocercospora fijiensis

Stel je een wereld voor waarin een kleine, onzichtbare indringer langzaam de voedselvoorraad van miljoenen mensen opeet. Dit is geen verhaal over een zombievirus of een gigantische robot; het gaat over een schimmel genaamd Pseudocercospora fijiensis, de boosdoener achter de "Black Leaf Streak Disease" (zwarte bladstreepziekte). Deze schimmel valt bananenplanten aan, waarbij de groene bladeren veranderen in bruine, necrotische rommel. Omdat bananen een basisvoedsel zijn voor honderden miljoenen mensen en een enorme wereldwijde exportproduct zijn, is deze ziekte een groot probleem. Momenteel bestrijden boeren dit met een chemische blitz: het spuiten van fungiciden tot wel 70 keer per jaar. Het is duur, slecht voor het milieu en onhoudbaar. De enige echte lange-termijnoplossing is het kweken van bananen die van nature resistent zijn, maar om dat te doen, moeten wetenschappers precies begrijpen hoe de schimmel werkt.

Het probleem is dat deze schimmel berucht moeilijk te bestuderen is. Het is alsof je een horloge probeert te repareren terwijl je dikke lashandschoenen draagt; de instrumenten die wetenschappers gewoonlijk gebruiken om genen te prikken en te testen, werken hier niet goed. De schimmel groeit langzaam, is moeilijk te manipuleren, en eerdere pogingen om het DNA te bewerken waren als het gooien van pijltjes in het donker — ze misten meestal het doel. Maar er is een nieuw instrument gearriveerd in de wetenschappelijke gereedschapskist: CRISPR/Cas9. Denk aan CRISPR als een paar moleculaire scharen die geprogrammeerd kunnen worden om met ongelooflijke precisie een specifiek stukje DNA door te knippen. Als je op de juiste plek kunt knippen, kun je ofwel een gen uitschakelen om te zien wat er gebeurt (een "knockout"), of een nieuwe instructie erin plakken. Maar om deze scharen te gebruiken, moet je ze eerst in de cel van de schimmel krijgen, die beschermd wordt door een taai buitenste omhulsel. Dit artikel is het verhaal van hoe een team wetenschappers er eindelijk in slaagde om dat omhulsel af te breken, de scharen naar binnen te smokkelen en te beginnen met het bewerken van de code van de bananenschimmel.

De Doorbraak bij de Bananenschimmel: De Code Knippen

Al een lange tijd is de bananenschimmel Pseudocercospora fijiensis een "black box" voor wetenschappers. Ze wisten dat het Black Leaf Streak Disease veroorzaakte, wat oogsten ruïneerde en boeren dwong om constant giftige chemicaliën te spuiten, maar ze konden niet gemakkelijk ontdekken hoe het dat deed. De schimmel is koppig; hij laat zich niet graag in laboratoria kweken, en de celwanden zijn zo taai dat het bijna onmogelijk is om genetische instrumenten naar binnen te krijgen. De auteurs van dit artikel, onder leiding van Maikel Steentjes en collega's, besloten een nieuwe sleutel te bouwen om deze box te openen. Hun doel was om een betrouwbare methode te creëren om CRISPR/Cas9 — die moleculaire scharen — te gebruiken om de genen van de schimmel te bewerken en te zien wat er gebeurt als specifieke delen worden afgebroken.

Eerst moest het team het "toegangsprobleem" oplossen. Om de scharen naar binnen te krijgen, moesten ze de schimmel veranderen in een naakte cel, of een "protoplast", door de taai buitenste wand op te lossen. Ze behandelden de schimmel als een delicate taart en testten verschillende recepten van enzymen (biologische scharen die celwanden opeten) om te zien welke mix het beste werkte. Ze ontdekten dat een specifieke cocktail van vier enzymen, toegepast op een schimmel die exact 40 uur in een vloeibaar medium was gekweekt, de winnende combinatie was. Dit proces was zo efficiënt dat ze 96% van hun doelcellen in protoplasten konden veranderen zonder ze te doden. Zodra de cellen naakt waren, gebruikten ze een methode genaamd PEG-gemedieerde transformatie, wat lijkt op het geven van een zachte elektrische schok aan de cellen zodat ze het nieuwe DNA naar binnen happen. Ze testten ook welke "antibiotica-tags" (hygromycine B en nourseothricine) de schimmel zou overleven, zodat ze de succesvolle bewerkingen later konden selecteren.

Nu de deur openstond, testte het team hun CRISPR-schaar op drie verschillende genen om te zien of het systeem werkte.

1. Het Melanine-gen (PKS10-1): Dit gen is verantwoordelijk voor het zwart maken van de schimmel. De wetenschappers wilden zien of ze de schimmel geel konden maken door dit gen door te knippen. Het werkte perfect. Van de 23 pogingen resulteerden er 22 in gele, melaninevrije kolonies. Dat is een succespercentage van 96%. Ze bewezen zelfs dat het het juiste gen was door het terug te plaatsen en te kijken hoe de schimmel weer zwart werd.
2. Het Groei-gen (Fus3): Dit gen helpt de schimmel planten binnen te dringen. Wanneer ze dit doorknipten, groeide de schimmel veel langzamer en zag hij er vreemd uit. Ongeveer 58% van de pogingen slaagde erin het gen te breken.
3. Het "Wapen"-gen (Avr4): Dit was het grote mysterie. Eerdere studies suggereerden dat Avr4 een speciaal eiwit is dat de schimmel gebruikt om bananen aan te vallen, en dat een resistente bananensoort genaamd "Calcutta 4" dit eiwit zou herkennen en zou terugvechten. De wetenschappers gebruikten hun nieuwe CRISPR-systeem om het Avr4-gen volledig te verwijderen.

Hier neemt het verhaal een wending. Wanneer de wetenschappers normale, vatbare bananen (het Cavendish-ras) infecteerden met de schimmel waarvan het Avr4-gen was verwijderd, veroorzaakte de schimmel even ernstige ziektesymptomen als het wildtype, wat aantoonde dat het vermogen om te infecteren niet verminderd was. Het "wapen" was niet echt nodig om de strijd te winnen. Maar de echte verrassing kwam toen ze de resistente Calcutta 4 bananen testten. Zelfs zonder het Avr4-gen kon de schimmel hen nog steeds niet infecteren, en de planten lanceerden nog steeds een defensieve reactie.

Deze bevinding sluit expliciet de gedachte uit dat Avr4 de belangrijkste reden is voor de resistentie van Calcutta 4. De auteurs laten zien dat de resistentie niet wordt getriggerd door de schimmel die zijn Avr4-vlag laat zien; in plaats daarvan moet de plant een ander, onbekend "geheim wapen" herkennen dat de schimmel nog steeds bij zich draagt. Het artikel suggereert dat Calcutta 4 waarschijnlijk let op een heel team van schimmeleiwitten, en niet slechts op één enkel eiwit.

Het artikel concludeert dat hun nieuwe CRISPR-systeem een game-changer is. Het is zeer efficiënt en stelt wetenschappers in staat om genen met hoge precisie te breken (tot 96% succes voor sommige doelwitten). Dit instrument verwijdert de grootste barrière voor het bestuderen van deze moeilijke schimmel. Hoewel ze niet de "magische kogel" voor resistentie in het Avr4-gen hebben gevonden, bewezen ze dat de schimmel nog andere trucs in zijn mouwen heeft. Nu de wetenschappers een betrouwbare manier hebben om de DNA van de schimmel te knippen en te plakken, kunnen ze beginnen met het zoeken naar die andere verborgen effectoren. Dit opent de deur naar het eindelijk begrijpen van de moleculaire strijd tussen de banaan en de schimmel, wat de eerste stap is naar het kweken van bananen die uit zichzelf kunnen terugvechten, waardoor de oogst wordt gered van de noodzaak voor constante chemische bestrijding.