An in vivo chemical genetic approach for targeted glycoproteome analysis in Drosophila melanogaster

La vita si basa su molto più del semplice codice genetico scritto nel DNA. Sebbene i geni forniscano le istruzioni per la produzione delle proteine, la forma e la funzione finali di tali proteine dipendono spesso da un secondo strato di decorazione. Immaginate una proteina come una camicia bianca semplice; il codice genetico ne determina il taglio e il tessuto, ma la cellula spesso aggiunge intricati motivi di molecole di zucchero sulla superficie. Questi rivestimenti di zucchero, noti come glicani, non sono meri ornamenti. Fungono da distintivi di identificazione, colla per tenere unite le cellule e segnali che dicono alle proteine dove andare e come comportarsi. Quando questi modelli di zucchero vanno storti, ciò può portare a una vasta gamma di malattie. Tuttavia, studiare queste decorazioni di zucchero all'interno di un animale vivente è stato notoriamente difficile. A differenza dei geni, che possono essere facilmente letti e modificati, gli zuccheri sono prodotti da una complessa rete di enzimi che interagiscono in modi difficili da tracciare in tempo reale. Gli scienziati avevano a lungo avuto bisogno di un modo per osservare la formazione e il cambiamento di questi modelli di zucchero all'interno di una creatura vivente senza interromperne la vita naturale.

Un team di ricercatori ha ora sviluppato un nuovo metodo per risolvere questo problema utilizzando il moscerino della frutta, un minuscolo insetto che è stato una pietra miliare della scoperta biologica per oltre un secolo. Hanno creato un sistema che chiamano FlyMOE, che permette loro di marcare specifiche molecole di zucchero all'interno di un moscerino vivente e poi scoprire esattamente quali proteine le trasportano. L'approccio si basa su un astuto trucco che sfrutta la biologia del moscerino stesso. Normalmente, i moscerini producono i propri mattoni di zucchero partendo da zero. I ricercatori hanno introdotto un nuovo set di geni nei moscerini che agiscono come una linea di fabbrica personalizzata. Questa fabbrica è progettata per prendere uno zucchero speciale e modificato che i ricercatori somministrano ai moscerini e convertirlo in una forma che le cellule del moscerino possano utilizzare. Questo zucchero modificato trasporta una piccola maniglia chimica, come un piccolo gancio, che non esiste in natura. Mentre il moscerino cresce, incorpora questi zuccheri dotati di gancio nelle sue proteine, etichettandole efficacemente con un identificatore unico.

Una volta che i moscerini hanno incorporato questi tag, i ricercatori possono usare una reazione chimica per attaccare un'etichetta luminosa al gancio. Ciò consente loro di estrarre le proteine marcate dal complesso miscuglio del corpo del moscerino ed esaminarle da vicino. Il team ha testato questo metodo in diverse fasi della vita del moscerino, dall'embrione iniziale fino allo stadio adulto. Hanno scoperto che il metodo funzionava bene, marcando con successo le proteine in vari tessuti come l'intestino, il sistema nervoso e le ali in via di sviluppo. Utilizzando la potente spettrometria di massa, una tecnica che pesa le molecole per identificarle, sono stati in grado di creare una mappa dettagliata delle proteine rivestite di zucchero trovate negli embrioni di moscerino e nei tessini delle ali. Questa mappa ha rivelato molte proteine note, ma ha anche scoperto diverse proteine che non erano mai state identificate prima come portatrici di decorazioni di zucchero.

I ricercatori non si sono fermati al semplice ritrovamento delle proteine marcate; volevano sapere quali enzimi specifici fossero responsabili dell'aggiunta degli zuccheri a quali proteine. Nel moscerino, una famiglia di enzimi chiamati PGANT è responsabile dell'inizio del processo di aggiunta degli zuccheri alle proteine. Per vedere quale enzima faccia cosa, il team ha utilizzato una strategia nota come ingegneria "bump-and-hole" (protuberanza e buco). Hanno leggermente alterato la forma del sito attivo di questi enzimi, creando una piccola "buca" che poteva accettare solo una molecola di zucchero dalla forma speciale "protuberante". Hanno poi alimentato i moscerini con questo zucchero protuberante. Poiché gli enzimi naturali del moscerino non potevano accettare questa forma protuberante, solo gli enzimi ingegnerizzati potevano usarla per marcare i loro specifici bersagli proteici. Questo ha permesso ai ricercatori di isolare e identificare esattamente le proteine che un singolo tipo di enzima stava modificando.

Utilizzando questo metodo preciso, il team ha scoperto che un enzima specifico, PGANT9A, e un altro chiamato PGANT35A, modificano entrambi una proteina chiamata Nidogen. La Nidogen è un componente chiave della membrana basale, un sottile strato di tessuto che sostiene le cellule e aiuta a tenerle insieme. Sebbene questa proteina sia nota per essere rivestita di zucchero negli esseri umani, dove svolge un ruolo nel cancro e nei disturbi neurologici, non era noto che trasportasse queste specifiche decorazioni di zucchero nei moscerini. Lo studio suggerisce che la versione di questa proteina nel moscerino sia un buon modello per studiare come funzionano questi rivestimenti di zucchero negli esseri umani. I ricercatori hanno confermato le loro scoperte mostrando che, quando esprimevano gli enzimi ingegnerizzati nelle cellule del moscerino, la proteina Nidogen veniva decorata con i tag di zucchero specifici, mentre gli enzimi naturali non lo facevano.

Questo lavoro stabilisce una piattaforma flessibile che può essere utilizzata per studiare la biologia degli zuccheri del moscerino della frutta con un dettaglio senza precedenti. Poiché il metodo può essere attivato in tessuti specifici o in momenti specifici utilizzando gli strumenti genetici del moscerino, apre la porta alla comprensione di come i modelli di zucchero cambino durante lo sviluppo di un animale o come differiscano tra le diverse parti del corpo. I ricercatori hanno dimostrato che il loro sistema funziona con diversi modi di somministrare lo zucchero, sia iniettandolo negli embrioni che nutrendo i moscerini adulti. Hanno anche dimostrato che il metodo non danneggia i moscerini né altera i loro modelli di zucchero naturali in modi indesiderati, garantendo che i risultati riflettano la vera biologia dell'organismo. Combinando gli strumenti chimici con il potere genetico del moscerino della frutta, questo approccio fornisce una finestra limpida sul mondo nascosto dei rivestimenti proteici di zucchero, offrendo un modo per tracciare l'attività di enzimi specifici e mappare i loro bersagli all'interno di un animale vivente e respirante.