An in vivo chemical genetic approach for targeted glycoproteome analysis in Drosophila melanogaster

Het leven is gebouwd op meer dan alleen de genetische code die in het DNA is geschreven. Hoewel genen de instructies leveren voor het maken van eiwitten, hangt de uiteindelijke vorm en functie van die eiwitten vaak af van een tweede laag decoratie. Stel je een eiwit voor als een wit, effen overhemd; de genetische code bepaalt de snit en de stof, maar de cel voegt vaak ingewikkelde patronen van suikermoleculen toe aan het oppervlak. Deze suikercoatings, bekend als glycanen, zijn geen louter versieringen. Ze fungeren als identificatiebewijzen, als lijm om cellen bij elkaar te houden, en als signalen die eiwitten vertellen waar ze heen moeten en hoe ze zich moeten gedragen. Wanneer deze suikerpatronen fout gaan, kan dit leiden tot een breed scala aan ziekten. Het bestuderen van deze suikerdecoraties binnen een levend dier is echter berucht moeilijk gebleken. In tegen tegenstelling tot genen, die gemakkelijk kunnen worden afgelezen en bewerkt, worden suikers geproduceerd door een complex web van enzymen die op manieren met elkaar interageren die moeilijk in realtime te volgen zijn. Wetenschappers hadden lang een manier nodig om te zien hoe deze suikerpatronen zich vormen en veranderen binnen een levend wezen zonder diens natuurlijke leven te verstoren.

Een team van onderzoekers heeft nu een nieuwe methode ontwikkeld om dit probleem op te lossen met behulp van de fruitvlieg, een klein insect dat al meer dan een eeuw een hoeksteen is van biologische ontdekkingen. Ze creëerden een systeem dat ze FlyMOE noemen, waarmee ze specifieke suikermoleculen in een levende vlieg kunnen labelen en vervolgens precies kunnen ontdekken welke eiwitten deze dragen. De aanpak steunt op een slim trucje waarbij gebruik wordt gemaakt van de eigen biologie van de vlieg. Normaal gesproken maken vliegen hun eigen suikerbouwstenen vanaf nul. De onderzoekers introduceerden een nieuwe set genen in de vliegen die fungeren als een aangepaste fabriekslijn. Deze fabriek is ontworpen om een speciale, gemodificeerde suiker te nemen die de onderzoekers aan de vliegen voeren, en deze om te zetten in een vorm die de cellen van de vlieg kunnen gebruiken. Deze gemodificeerde suiker draagt een klein chemisch handvat, zoals een klein haakje, dat niet in de natuur voorkomt. Terwijl de vlieg groeit, incorporeert hij deze gehaakte suikers in zijn eiwitten, waardoor ze effectief worden voorzien van een unieke identificatiecode.

Zodra de vliegen deze labels hebben geïncorporeerd, kunnen de onderzoekers een chemische reactie gebruiken om een helder label aan het haakje te bevestigen. Dit stelt hen in staat om de getagde eiwitten uit het complexe mengsel van het lichaam van de vlieg te halen en ze nauwkeurig te onderzoeken. Het team testte deze methode in verschillende stadia van het leven van de vlieg, van het vroegste embryo tot het volwassen stadium. Ze ontdekten dat de methode goed werkte en succesvol eiwitten labelde in diverse weefsels, zoals de darmen, het zenuwstelsel en de ontwikkelende vleugels. Door gebruik te maken van krachtige massaspectrometrie, een techniek die moleculen weegt om ze te identificeren, waren ze in staat om een gedetailleerde kaart te maken van de suiker-gecoate eiwitten in vliegembryo's en vleugelweefsels. Deze kaart onthulde veel bekende eiwitten, maar bracht ook verschillende eiwitten aan het licht die voorheen nooit waren geïdentificeerd als dragers van suikerdecoraties.

De onderzoekers stopten niet bij het simpelweg vinden van getagde eiwitten; ze wilden weten welke specifieke enzymen verantwoordelijk waren voor het toevoegen van de suikers aan welke eiwitten. In de vlieg is een familie enzymen genaamd PGANTs verantwoordelijk voor het starten van het proces van het toevoegen van suikers aan eiwitten. Om te zien welk enzym wat doet, gebruikte het team een strategie die bekend staat als "bump-and-hole" engineering. Ze veranderden de vorm van het actieve centrum van deze enzymen lichtjes, waardoor er een klein "gaatje" ontstond dat alleen een speciaal gevormd "bumped" suikermolecuul kon accepteren. Vervolgens voerden ze de vliegen deze "bumped" suiker. Omdat de natuurlijke enzymen in de vlieg de "bumped" vorm niet konden accepteren, konden alleen de bewerkte enzymen deze "bumped" vorm gebruiken om hun specifieke eiwitdoelen te labelen. Dit stelde de onderzoekers in staat om de exacte eiwitten te isoleren en te identificeren die door een enkele type enzym werden gemodificeerd.

Met deze precieze methode ontdekte het team dat een specifiek enzym, PGANT9A, en een ander genaamd PGANT35A, beide een eiwit genaamd Nidogen modificeren. Nidogen is een sleutelcomponent van de basale membraan, een dun weefsellayer die cellen ondersteunt en helpt ze bij elkaar te houden. Hoewel dit eiwit in mensen bekend is als suiker-gecoat, waar het een rol speelt bij kanker en neurologische aandoeningen, was het niet bekend dat het in vliegen deze specifieke suikerdecoraties draagt. De studie suggereert dat de vliegversie van dit eiwit een goed model is voor het bestuderen van hoe deze suikercoatings in mensen werken. De onderzoekers bevestigden hun bevindingen door aan te tonen dat wanneer zij de bewerkte enzymen in vliegcellen tot expressie brachten, het Nidogen-eiwit werd gedecoreerd met de specifieke suikertags, terwijl de natuurlijke enzymen dat niet deden.

Dit werk vestigt een flexibel platform dat kan worden gebruikt om de suikerbiologie van de fruitvlieg met ongekende precisie te bestuderen. Omdat de methode met behulp van de genetische instrumenten van de vlieg kan worden geactiveerd in specifieke weefsels of op specifieke tijdstippen, opent het de deur naar het begrijpen van hoe suikerpatronen veranderen tijdens de ontwikkeling van een dier of hoe ze verschillen tussen verschillende delen van het lichaam. De onderzoekers toonden aan dat hun systeem werkt met verschillende manieren van toediening van de suiker, of het nu gaat om injectie in embryo's of het voeren aan volwassen vliegen. Ze demonstreerden ook dat de methode de vliegen geen schade toebrengt of hun natuurlijke suikerpatronen op onbedoelde manieren verandert, wat garandeert dat de resultaten de ware biologie van het organisme weerspiegelen. Door chemische hulpmiddelen te combineren met de genetische kracht van de fruitvlieg, biedt deze aanpak een helder venster in de verborgen wereld van eiwit-suikercoatings, en biedt het een manier om de activiteit van specifieke enzymen te traceren en hun doelwitten in kaart te brengen binnen een levend, ademend dier.