An in vivo chemical genetic approach for targeted glycoproteome analysis in Drosophila melanogaster

Das Leben basiert auf mehr als nur dem genetischen Code, der in der DNA geschrieben steht. Während Gene die Anweisungen für die Herstellung von Proteinen liefern, hängt die endgültige Form und Funktion dieser Proteine oft von einer zweiten Schicht der Dekoration ab. Stellen Sie sich ein Protein wie ein schlichtes weißes Hemd vor; der genetische Code bestimmt den Schnitt und den Stoff, aber die Zelle fügt oft komplizierte Muster aus Zuckermolekülen auf der Oberfläche hinzu. Diese Zuckermantel, bekannt als Glykane, sind keine bloßen Ornamente. Sie fungieren als Identifikationsausweise, als Kleber, um Zellen zusammenzuhalten, und als Signale, die Proteinen sagen, wohin sie gehen sollen und wie sie sich verhalten sollen. Wenn diese Zuckermuster fehlerhaft sind, kann dies zu einer Vielzahl von Krankheiten führen. Es war jedoch bisher äußerst schwierig, diese Zuckermuster innerhalb eines lebenden Tieres zu untersuchen. Im Gegensatz zu Genen, die leicht gelesen und editiert werden können, werden Zucker durch ein komplexes Netz von Enzymen produziert, die auf eine Weise interagieren, die in Echtzeit schwer nachverfolgbar ist. Wissenschaftler benötigten schon lange einen Weg, um diese Zuckermuster innerhalb eines lebenden Lebewesens entstehen und sich verändern zu lassen, ohne dessen natürliches Leben zu stören.

Ein Forschungsteam hat nun eine neue Methode entwickelt, um dieses Problem mithilfe der Fruchtfliege zu lösen, einem winzigen Insekt, das seit über einem Jahrhundert ein Eckpfeiler biologischer Entdeckungen ist. Sie entwickelten ein System, das sie FlyMOE nennen, welches es ihnen ermöglicht, spezifische Zuckermoleküle in einer lebenden Fliege zu markieren und anschließend genau herauszufinden, welche Proteine sie tragen. Der Ansatz beruht auf einem klugen Trick unter Ausnutzung der eigenen Biologie der Fliege. Normalerweise stellen Fliegen ihre eigenen Zuckerbausteine von Grund auf selbst her. Die Forscher führten neue Gene in die Fliegen ein, die wie eine maßgeschneiderte Fließbandfertigung wirken. Diese Fabrik ist darauf ausgelegt, einen speziellen, modifizierten Zucker, den die Forscher den Fliegen zuführen, in eine Form umzuwandeln, die die Zellen der Fliege verwenden können. Dieser modifizierte Zucker trägt einen winzigen chemischen Griff, wie einen kleinen Haken, der in der Natur nicht vorkommt. Während die Fliege wächst, baut sie diese gehakten Zucker in ihre Proteine ein und markiert sie so effektiv mit einer einzigartigen Kennzeichnung.

Sobald die Fliegen diese Markierungen eingebaut haben, können die Forscher eine chemische Reaktion nutzen, um ein helles Label an den Haken zu heften. Dies ermöglicht es ihnen, die markierten Proteine aus dem komplexen Gemisch des Körpers der Fliege herauszuziehen und sie genau zu untersuchen. Das Team testete diese Methode in verschiedenen Stadien des Lebens der Fliege, vom frühen Embryo bis hin zum Erwachsenenstadium. Sie fanden heraus, dass die Methode gut funktionierte und erfolgreich Proteine in verschiedenen Geweben wie dem Darm, dem Nervensystem und den sich entwickelnden Flügeln markierte. Durch den Einsatz der leistungsstarken Massenspektrometrie, einer Technik, die Moleküle wiegt, um sie zu identifizieren, konnten sie eine detaillierte Karte der zuckerbeschichteten Proteine in Fliegenembryos und Flügelgeweben erstellen. Diese Karte enthüllte viele bekannte Proteine, deckte aber auch mehrere Proteine auf, die zuvor nie als Träger von Zuckermustern identifiziert worden waren.

Die Forscher beschränkten sich nicht nur darauf, die markierten Proteine zu finden; sie wollten auch wissen, welche spezifischen Enzyme dafür verantwortlich sind, die Zucker zu den jeweiligen Proteinen hinzuzufügen. In der Fliege ist eine Familie von Enzymen namens PGANTs dafür verantwortlich, den Prozess des Hinzufügens von Zuckern zu Proteinen zu starten. Um zu sehen, welches Enzym was macht, nutzte das Team eine Strategie, die als „Bump-and-Hole“-Engineering (Stoß-und-Loch-Engineering) bekannt ist. Sie veränderten leicht die Form des aktiven Zentrums dieser Enzyme und schufen ein kleines „Loch“, das nur einen speziell geformten „gebumpten“ Zuckermolekül akzeptieren konnte. Dann fütterten sie die Fliegen mit diesem „gebumpten“ Zucker. Da die natürlichen Enzyme in der Fliege diese „gebumpte“ Form nicht akzeptieren konnten, konnten nur die manipulierten Enzyme diesen gebumpten Zucker nutzen, um ihre spezifischen Proteinstrukturen zu markieren. Dies erlaubte es den Forschern, die exakten Proteine zu isolieren und zu identifizieren, die durch einen einzelnen Typ von Enzym modifiziert wurden.

Mit dieser präzisen Methode entdeckte das Team, dass ein spezifisches Enzym, PGANT9A, und ein weiteres namens PGANT35A, beide ein Protein namens Nidogen modifizieren. Nidogen ist eine Schlüsselkomponente der Basalmembran, einer dünnen Gewebeschicht, die Zellen stützt und hilft, sie zusammenzuhalten. Während dieses Protein beim Menschen bekanntlich zuckerbeschichtet ist und dort eine Rolle bei Krebs und neurologischen Störungen spielt, war bisher nicht bekannt, dass es in Fliegen diese spezifischen Zuckermuster trägt. Die Studie legt nahe, dass die Version dieses Proteins in der Fliege ein gutes Modell ist, um zu untersuchen, wie diese Zuckermäntel beim Menschen funktionieren. Die Forscher bestätigten ihre Ergebnisse, indem sie zeigten, dass das exprimierte manipulierte Enzym dazu führte, dass das Nidogen-Protein mit den spezifischen Zuckermarkierungen dekoriert wurde, während die natürlichen Enzyme dies nicht taten.

Diese Arbeit etabliert eine flexible Plattform, die verwendet werden kann, um die Zuckerbiologie der Fruchtfliege in beispielloser Detailtiefe zu untersuchen. Da die Methode unter Verwendung der genetischen Werkzeuge der Fliege in spezifischen Geweben oder zu spezifischen Zeiten aktiviert werden kann, öffnet sie die Tür zum Verständnis darüber, wie sich Zuckermuster während der Entwicklung eines Tieres ändern oder wie sie sich zwischen verschiedenen Körperteilen unterscheiden. Die Forscher zeigten, dass ihr System mit verschiedenen Arten der Zuckergabe funktioniert, sei es durch die Injektion in Embryonen oder die Fütterung adulter Fliegen. Sie demonstrierten auch, dass die Methode die Fliegen nicht schädigt oder ihre natürlichen Zuckermuster auf unerwünschte Weise verändert, wodurch sichergestellt wird, dass die Ergebnisse die wahre Biologie des Organismus widerspiegeln. Durch die Kombination chemischer Werkzeuge mit der genetischen Kraft der Fruchtfliege bietet dieser Ansatz ein klares Fenster in die verborgene Welt der Protein-Zuckermäntel und bietet eine Möglichkeit, die Aktivität spezifischer Enzyme zu verfolgen und ihre Zielstrukturen innerhalb eines lebenden, atmenden Tieres zu kartieren.