Multi-region two-photon calcium imaging in freely moving animals

Il cervello non è un singolo centro di comando isolato, ma una vasta rete di quartieri distanti, ognuno dei quali gestisce compiti specifici pur comunicando costantemente con gli altri. Per comprendere come emergano comportamenti complessi come correre, arrampicarsi o cantare, gli scienziati devono osservare questi quartieri distanti che si attivano in sincronia. Per decenni, gli strumenti disponibili per osservare questa attività hanno imposto una scelta difficile. I ricercatori potevano scegliere tra l'usare minuscole telecamere per osservare una singola area cerebrale in un animale in movimento libero, oppure potevano usare elettrodi per ascoltare molte aree contemporaneamente, ma gli elettrodi spesso danneggiavano i tessuti o perdevano traccia delle stesse cellule nel tempo. Il gold standard per vedere le singole cellule in azione è una tecnica chiamata microscopia a due fotoni, che utilizza la luce focalizzata per scrutare in profondità all'interno del tessuto vivente con un'incredibile chiarezza. Tuttavia, l'attrezzatura necessaria per questo imaging di alta qualità è stata storicamente troppo pesante da trasportare per un piccolo animale, limitando queste viste dettagliate ad animali che erano o sedati o vincolati a una macchina stazionaria.

Un team di ricercatori ha ora costruito una soluzione che rompe questa barriera del peso, permettendo di osservare i quartieri distanti del cervello che lavorano insieme in tempo reale mentre l'animale si muove liberamente. Hanno creato un nuovo dispositivo, un microscopio in miniatura che pesa solo 1,1 grammi, abbastanza leggero da essere trasportato da un topo o persino da un piccolo uccello canoro senza ostacolare il loro comportamento naturale. Montando due di questi dispositivi su un singolo animale, gli scienziati sono stati in grado di registrare da due regioni cerebrali separate simultaneamente per la prima volta con questo livello di dettaglio. Hanno dimostrato che questa configurazione funziona per studiare come le due metà del cervello si coordinano durante compiti fisici difficili, come le regioni cerebrali vicine codificano le informazioni spaziali e come i cervelli degli uccelli giovani imparano a cantare. Questo lavoro apre una finestra sull'attività coordinata dei circuiti neurali distribuiti, mostrando che le complesse conversazioni del cervello possono essere osservate nel loro pieno e naturale contesto.

Il cuore di questo traguardo è il design del nuovo microscopio stesso, che i ricercatori chiamano MINI2P-II. I tentativi precedenti di rimpicciolire i microscopi a due fotoni spesso risultavano in una perdita di qualità dell'immagine o della capacità di vedere in profondità nel cervello. Il nuovo dispositivo supera questo problema ripensando a come la luce viaggia attraverso lo strumento. Inveverso di utilizzare molte lenti e specchi separati, i progettisti hanno combinato diverse funzioni in singoli componenti e hanno ripiegato i percorsi della luce in modo che occupassero lo stesso spazio fisico. Hanno anche sostituito le pesanti parti metalliche con materiali in fibra di carbonio ultraleggeri e utilizzato un nuovo tipo di cavo in fibra ottica che mantiene stabile la luce del laser anche quando l'animale ruota e gira. Il risultato è un dispositivo che pesa meno della metà rispetto ai suoi predecessori, ma offre immagini più nitide, un campo visivo più ampio e la capacità di vedere più in profondità nei tessuti cerebrali. Fondamentalmente, il dispositivo è modulare, il che significa che diverse parti possono essere sostituite o aggiornate senza dover ricostruire l'intero sistema.

Per dimostrare che questo dispositivo leggero potesse catturare l'attività cerebrale durante movimenti vigorosi, i ricercatori lo hanno testato su topi che eseguivano un compito fisico impegnativo. Hanno addestrato i topi a scalare una scala verticale per raggiungere una ricompensa alimentare, un comportamento che richiede una coordinazione precisa delle zampe anteriori e posteriori. Utilizzando due microscopi MINI2P-II, hanno registrato dalla corteccia motoria su entrambi i lati del cervello contemporaneamente. I dati hanno rivelato che i due lati del cervello non si rispecchiano semplicemente. Durante la scalata, l'attività nel lato destro del cervello precedeva costantemente l'attività nel lato sinistro di una frazione di secondo, suggerendo una sequenza specifica di comandi per questo movimento complesso. Inoltre, osservando le singole cellule piuttosto che solo l'attività media, hanno scoperto che gruppi specifici di neuroni su entrambi i lati del cervello si attivavano insieme in cluster stretti durante la scalata, mentre altri gruppi si attivavano in opposizione. Questi intricati modelli di coordinazione erano invisibili guardando solo un lato del cervello o mediando l'attività di tutte le cellule insieme.

I ricercatori hanno anche dimostrato che questa tecnologia poteva essere utilizzata per studiare regioni cerebrali molto vicine tra loro, un compito che era precedentemente impossibile con due microscopi separati perché i dispositivi si sarebbero fisicamente scontrati sulla testa dell'animale. Hanno sviluppato un nuovo assemblaggio ottico, essenzialmente un piccolo periscopio fatto di lenti e prismi specializzati, che sposta la visuale del microscopio lateralmente e verso il basso. Ciò ha permesso loro di montare due microscopi sullo stesso lato della testa di un topo pur guardando due diverse aree cerebrali adiacenti. Utilizzando questa configurazione, hanno registrato dalla corteccia retrospleniale e dalla corteccia parietale posteriore, due regioni note per aiutare gli animali a navigare nel loro ambiente. Hanno scoperto che, sebbene entrambe le regioni contenessero cellule che si attivavano quando l'animale era vicino a un muro, le cellule nella corteccia retrospleniale erano molto più propense ad attivarsi quando il muro era sul lato sinistro dell'animale, mentre le cellule nella corteccia parietale mostravano una risposta più equilibrata ai muri su entrambi i lati. Questa sottile differenza nel modo in cui le due regioni mappano il mondo sarebbe stata impossibile da rilevare senza registrare da entrambe le aree simultaneamente nello stesso animale.

Infine, l'estrema leggerezza del dispositivo ha permesso al team di estendere questi studi ad animali molto più piccoli e a fasi di sviluppo più giovani. Hanno utilizzato con successo i microscopi per registrare dai cervelli di zebre finch, un piccolo uccello canoro. Negli uccelli adulti, hanno osservato che le cellule cerebrali responsabili del controllo del canto rimanevano silenziose mentre l'uccello interagiva con una femmina, ma si attivavano bruscamente nel momento in cui l'uccello iniziava a cantare. Hanno anche registrato da un uccello giovane che stava ancora imparando a cantare. In questi uccelli giovani, le cellule cerebrali erano attive anche quando l'uccello non cantava, suggerendo uno stato di costante pratica e apprendimento. Questo livello di dettaglio in un uccello giovane che si muove liberamente era precedentemente irraggiungibile, poiché microscopi più vecchi e pesanti sarebbero stati troppo gravosi da trasportare per l'animale così piccolo.

Il successo di questo progetto dimostra che i limiti di peso e dimensione degli strumenti di neuroscienza non sono insormontabili. Combinando un microscopio radicalmente ridisegnato con ingegnose scorteccie ottiche, i ricercatori hanno fornito un nuovo modo per osservare il funzionamento del cervello. Hanno dimostrato che i complessi comportamenti del cervello derivano da conversazioni dinamiche e coordinate tra regioni distanti e vicine, conversazioni che possono ora essere osservate mentre gli animali si muovono liberamente nel loro mondo. Questo approccio offre una nuova potente lente per comprendere come i circuiti neurali si sviluppano, come imparano e come falliscono, il tutto senza interrompere i comportamenti naturali che gli scienziati cercano di comprendere.