Multi-region two-photon calcium imaging in freely moving animals

O cérebro não é um centro de comando único e isolado, mas uma vasta rede de bairros distantes, cada um lidando com tarefas específicas enquanto conversam constantemente entre si. Para entender como comportamentos complexos como correr, escalar ou cantar emergem, os cientistas devem observar esses bairros distantes disparando em uníssono. Por décadas, as ferramentas disponíveis para observar essa atividade forçaram uma escolha difícil. Os pesquisadores podiam ou usar câmeras minúsculas para observar uma única área cerebral em um animal que se movia livremente, ou podiam usar eletrodos para ouvir muitas áreas ao mesmo tempo, mas os eletrodos frequentemente danificavam o tecido ou perdiam o rastro das mesmas células ao longo do tempo. O padrão ouro para ver células individuais em ação é uma técnica chamada microscopia de dois fótons, que utiliza luz focalizada para espiar profundamente dentro do tecido vivo com uma clareza incrível. No entanto, o equipamento necessário para essa imagem de alta qualidade tem sido, historicamente, pesado demais para um animal pequeno carregar, limitando essas visões detalhadas a animais que estão ou sedados ou presos a uma máquina estacionária.

Uma equipe de pesquisadores construiu agora uma solução que quebra essa barreira de peso, permitindo que observem os bairros distantes do cérebro trabalhando juntos em tempo real enquanto o animal se move livremente. Eles criaram um novo dispositivo, um microscópio minúsculo que pesa apenas 1,1 gramas, leve o suficiente para ser carregado por um camundongo ou até mesmo por um pequeno pássaro sem prejudicar seu comportamento natural. Ao montar dois desses dispositivos em um único animal, os cientistas foram capazes de registrar de duas regiões cerebrais separadas simultaneamente pela primeira vez com este nível de detalhe. Eles demonstraram que esta configuração funciona para estudar como as duas metades do cérebro se coordenam durante tarefas físicas difíceis, como regiões cerebrais próximas codificam informações espaciais e como os cérebros de aves jovens aprendem a cantar. Este trabalho abre uma janela para a atividade coordenada de circuitos neurais distribuídos, mostrando que as conversas complexas do cérebro podem ser observadas em seu contexto total e natural.

O cerne desta conquista é o design do novo microscópio em si, que os pesquisadores chamam de MINI2P-II. Tentativas anteriores de encolher microscópios de dois fótons frequentemente resultavam em uma perda de qualidade de imagem ou da capacidade de ver profundamente no cérebro. O novo dispositivo supera isso repensando como a luz viaja através do instrumento. Em vez de usar muitas lentes e espelhos separados, os designers combinaram várias funções em componentes únicos e dobraram os caminhos da luz para que ocupassem o mesmo espaço físico. Eles também substituíram partes metálicas pesadas por materiais de fibra de carbono leves e usaram um novo tipo de cabo de fibra óptica que mantém a luz do laser estável mesmo quando o animal gira e vira. O resultado é um dispositivo que pesa menos da metade de seus predecessres, mas oferece imagens mais nítidas, um campo de visão mais amplo e a capacidade de ver mais profundamente no tecido cerebral. Crucialmente, o dispositivo é modular, o que significa que diferentes partes podem ser trocadas ou atualizadas sem reconstruir todo o sistema.

Para provar que este dispositivo leve poderia capturar a atividade cerebral durante movimentos vigorosos, os pesquisadores o testaram em camundongos realizando uma tarefa física desafiadora. Eles treinaram camundongos para escalar uma escada vertical para alcançar uma recompensa alimentar, um comportamento que requer coordenação precisa das pernas dianteiras e traseiras. Usando dois microscópios MINI2P-II, eles registraram do córtex motor em ambos os lados esquerdo e direito do cérebro ao mesmo tempo. Os dados revelaram que os dois lados do cérebro não apenas se espelham. Durante a escalada, a atividade no lado direito liderou consistentemente a atividade no lado esquerdo por uma fração de segundo, sugerindo uma sequência específica de comandos para este movimento complexo. Além disso, quando observaram células individuais em vez de apenas a atividade média, descobriram que grupos específicos de neurônios em ambos os lados do cérebro disparavam juntos em agrupamentos apertados durante a escalada, enquanto outros grupos disparavam em oposição. Esses padrões intrincados de coordenação eram invisíveis quando se olhava apenas para um lado do cérebro ou quando se media a atividade de todas as células juntas.

Os pesquisadores também mostraram que esta tecnologia poderia ser usada para estudar regiões cerebrais que estão muito próximas uma da outra, uma tarefa que era anteriormente impossível com dois microscópios separados porque os dispositivos colidiriam fisumente na cabeça do animal. Eles desenvolveram um novo conjunto óptico, essencialmente um periscópio minúsculo feito de lentes e prismas especializados, que desloca a visão do microscópio lateral e inferiormente. Isso permitiu que montassem dois microscópios no mesmo lado da cabeça de um camundongo e, ainda assim, olhassem para duas áreas cerebrais adjacentes e diferentes. Usando esta configuração, eles registraram do córtex retrosplenial e do córtex parietal posterior, duas regiões conhecidas por ajudar os animais a navegar em seu ambiente. Eles descobriram que, embora ambas as regiões contivessem células que disparavam quando o animal estava perto de uma parede, as células no córtex retrosplenial eram muito mais propensas a disparar quando a parede estava no lado esquerdo do animal, enquanto as células no córtex parietal mostravam uma resposta mais equilibrada a paredes em ambos os lados. Essa diferença sutil na forma como as duas regiões mapeiam o mundo teria sido impossível de detectar sem registrar de ambas as áreas simultaneamente no mesmo animal.

Finalmente, a extrema leveza do dispositivo permitiu que a equipe expandisse estes estudos para animais muito menores e estágios de desenvolvimento mais jovens. Eles utilizaram com sucesso os microscópios para registrar os cérebros de tentilhões, uma espécie de pequeno pássaro cantor. Em aves adultas, observaram que as células cerebrais responsáveis pelo controle do canto permaneciam quietas enquanto a ave interagia com uma fêmea, mas entravam em atividade no momento em que a ave começava a cantar. Eles também registraram de uma ave juvenil que ainda estava aprendendo a cantar. Nessas aves jovens, as células cerebrais estavam ativas mesmo quando a ave não estava cantando, sugerindo um estado de prática e aprendizado constante. Este nível de detalhe em um pássaro juvenil que se move livremente era anteriormente inalcançável, pois microscópios mais antigos e pesados seriam excessivos para o pequeno animal carregar.

O sucesso deste projeto demonstra que as limitações de peso e tamanho nas ferramentas da neurociência não são insuperáveis. Ao combinar um microscópio radicalmente redesenhado com acessórios ópticos inteligentes, os pesquisadores forneceram uma nova maneira de observar o cérebro em funcionamento. Eles mostraram que os comportamentos complexos do cérebro surgem de conversas dinâmicas e coordenadas entre regiões distantes e próximas, conversas que agora podem ser observadas em animais movendo-se livremente em seu mundo. Esta abordagem oferece uma nova lente poderosa para entender como os circuitos neurais se desenvolvem, como eles aprendem e como falham, tudo isso sem interromper os comportamentos naturais que os cientistas buscam compreender.