Multi-region two-photon calcium imaging in freely moving animals

Het brein is geen enkelvoudig, geïsoleerd commandocentrum, maar een uitgestrekt netwerk van verre buurten, die elk specifieke taken afhandelen terwijl ze voortdurend met elkaar communiceren. Om te begrijpen hoe complexe gedragingen zoals rennen, klimmen of zingen ontstaan, moeten wetenschappers kijken naar hoe deze verre buurten in unisono vuren. Decennialang dwongen de beschikbare instrumenten om deze activiteit te observeren onderzoekers tot een moeilijke keuze. Onderzoekers konden ofwel minuscule camera's gebruiken om een enkel hersengebied bij een vrij bewegend dier te observeren, of zij konden elektroden gebruiken om tegelijkertijd naar veel gebieden te luisteren, maar de elektroden beschadigden vaak het weefsel of verloren na verloop van tijd het spoor van dezelfde cellen. De gouden standaard voor het zien van individuele cellen in actie is een techniek genaamd tweefotonmicroscopie, die gefocust licht gebruikt om met ongelooflijke helderheid diep in levend weefsel te kijken. De apparatuur die nodig is voor deze hoogwaardige beeldvorming was echter historisch gezien te zwaar voor een klein dier om te dragen, wat deze gedetailleerde inzichten beperkte tot dieren die ofwel gesedeerd waren of vastzaten aan een stationaire machine.

Een team van onderzoekers heeft nu een oplossing gebouwd die deze gewichtsgrens doorbreekt, waardoor ze de verre buurten van het brein in real time kunnen zien samenwerken terwijl het dier vrij beweegt. Ze creëerden een nieuw apparaat, een miniatuurmicroscoop die slechts 1,1 gram weegt, die licht genoeg is om door een muis of zelfs een kleine zangvogel gedragen te worden zonder het natuurlijke gedrag te hinderen. Door twee van deze apparaten op één enkel dier te monteren, waren de wetenschappers er voor het eerst in geslaagd om gelijktijdig vanuit twee afzonderlijke hersenregio's op te nemen met dit niveau van detail. Ze toonden aan dat deze opstelling werkt voor het bestuderen van hoe de twee helften van het brein coördineren tijdens veeleisende fysieke taken, hoe nabijgelegen hersenregio's ruimtelijke informatie coderen, en hoe de hersenen van jonge vogels leren zingen. Dit werk opent een venster naar de gecoördineerde activiteit van gedistribueerde neurale circuits, waarbij laat zien dat de complexe gesprekken van het brein geobserveerd kunnen worden in hun volledige, natuurlijke context.

De kern van deze prestatie is het ontwerp van de nieuwe microscoop zelf, die de onderzoekers MINI2P-II noemen. Eerdere pogingen om tweefotonmicroscopen te verkleinen resulteerden vaak in een verlies van beeldkwaliteit of het vermogen om diep in de hersenen te kijken. Het nieuwe apparaat overwint dit door te heroverwegen hoe licht door het instrument reist. In plaats van veel afzonderlijke lenzen en spiegels te gebruiken, combineerden de ontwerpers verschillende functies in enkele componenten en vouwden ze de lichtpaden zodat ze dezelfde fysieke ruimte innemen. Ze vervingen ook zware metalen onderdelen door lichtgewicht koolstofvezelmaterialen en gebruikten een nieuw type glasvezelkabel die het laserlicht stabiel houdt, zelfs wanneer het dier draait en wendt. Het resultaat is een apparaat dat minder dan de helft van het gewicht van zijn voorgangers is, maar scherpere beelden biedt, een breder gezichtsveld en het vermogen om dieper in het hersenweefsel te kijken. Cruciaal is dat het apparaat modulair is, wat betekent dat verschillende onderdelen kunnen worden uitgewisseld of geüpgraded zonder het hele systeem opnieuw op te bouwen.

Om te bewijzen dat dit lichtgewicht apparaat de hersenactiviteit tijdens krachtige beweging kon vastleggen, testten de onderzoekers het op muizen die een uitdagende fysieke taak uitvoerden. Ze trainden muizen om een verticale ladder te beklimmen om een voedingsbeloning te bereiken, een gedrag dat een nauwkeurige coördinatie van de voor- en achterpoten vereist. Met behulp van twee MINI2P-II microscopen namen ze gelijktijdig op vanuit de motorische cortex aan beide kanten van de hersenen. De gegevens onthulden dat de twee zijden van het brein elkaar niet simpelweg spiegelen. Tijdens de klim ging de activiteit in de rechterkant van het brein consequent een fractie van een seconde vooraf op de activiteit in de linkerkant, wat wijst op een specifieke sequentie van commando's voor deze complexe beweging. Bovendien, toen ze naar individuele cellen keken in plaats van alleen naar de gemiddelde activiteit, ontdekten ze dat specifieke groepen neuronen aan beide zijden van het brein samen vuurden in nauwe clusters tijdens de klim, terwijl andere groepen in tegenstelling tot elkaar vuurden. Deze ingewikkelde patronen van coördinatie waren onzichtbaar wanneer men slechts naar één kant van het brein keek of de activiteit van alle cellen gemiddeld nam.

De onderzoekers toonden ook aan dat deze technologie gebruikt kan worden om hersenregio's te bestuderen die zeer dicht bij elkaar liggen, een taak die voorheen onmogelijk was met twee afzonderlijke microscopen omdat de apparaten fysiek tegen elkaar zouden botsen op de kop van het dier. Ze ontwikkelden een nieuwe optische assemblage, in feite een piepkleine periscoop gemaakt van gespecialiseerde lenzen en prisma's, die het zicht van de microscoop zijwaarts en omlaag verschuift. Dit stelde hen in staat om twee microscopen aan dezelfde kant van een muizenkop te monteren en toch naar twee verschillende, aangrenzende hersengebieden te kijken. Met deze opstelling namen ze op vanuit de retrospleniale cortex en de posterieure parietale cortex, twee regio's die erom bekend staan dat ze dieren helpen navigeren in hun omgeving. Ze ontdekten dat hoewel beide regio's cellen bevatten die vuurden wanneer het dier nabij een muur was, de cellen in de retrospleniale cortex veel vaker vuurden wanneer de muur aan de linkerkant van het dier was, terwijl de cellen in de parietale cortex een meer gebalanceerde respons vertoonden op muren aan beide kanten. Dit subtiele verschil in hoe de twee regio's de wereld in kaart brengen, zou zonder het gelijktijdig opnemen uit beide gebieden in hetzelfde dier niet te detecteren zijn geweest.

Ten slotte maakte het extreme lichte gewicht van het apparaat het voor het team mogelijk om deze studies uit te breiden naar veel kleinere dieren en jongere ontwikkelingsstadia. Ze gebruikten de microscopen succesvol om opnames te maken van de hersenen van zebra vanjes, een kleine zangvogelsoort. Bij volwassen vogels observeerden ze dat de hersencellen die verantwoordelijk zijn voor de zangcontrole stil bleven terwijl de vogel met een vrouwtje interacteerde, maar in actie kwamen op het moment dat de vogel begon te zingen. Ze namen ook op bij een jonge vogel die nog aan het leren was om te zingen. In deze jonge vogels waren de hersencellen actief, zelfs wanneer de vogel niet aan het zingen was, wat wijst op een staat van constante oefening en leren. Dit niveau van detail in een vrij bewegende jonge vogel was voorheen onbereikbaar, aangezien oudere, zwaardere microscopen te belastend zouden zijn geweest voor het kleine dier om te dragen.

Het succes van dit project toont aan dat de beperkingen van gewicht en omvang in neurowetenschappelijke instrumenten niet onoverkomelijk zijn. Door een radicaal herontworpen microscoop te combineren met slimme optische accessoires, hebben de onderzoekers een nieuwe manier geboden om het brein te zien werken. Ze hebben aangetoond dat de complexe gedragingen van het brein voortkomen uit dynamische, gecoördineerde gesprekken tussen verre en nabije regio's, gesprekken die nu geobserveerd kunnen worden in dieren die vrij bewegen door hun wereld. Deze aanpak biedt een krachtige nieuwe lens voor het begrijpen van hoe neurale circuits zich ontwikkelen, hoe ze leren en hoe ze falen, zonder daarbij de natuurlijke gedragingen te verstoren die wetenschappers juist willen begrijpen.