Nasal Gene Expression in ART-Naive Adults with HIV and Pulmonary Tuberculosis in Uganda

Sintesi Tecnica: Espressione Genica Nasale in Adulti Naïve alla ART con HIV e Tubercolosi Polmonare in Uganda

Problematica
La diagnosi della tubercolosi (TB) polmonare nelle persone che vivono con l'HIV (PLHIV) rimane una sfida critica, in particolare nelle popolazioni naïve alla terapia antiretrovirale (ART). Le PLHIV spesso presentano una malattia paucibacillare e difficoltà nell'espettorazione dell'espettorato, limitando l'efficacia delle diagnostiche standard basate sull'espettorato come la coltura o Xpert MTB/RIF Ultra. Sebbene i biomarcatori di mRNA nel sangue abbiano mostrato potenziale come test di triage, le loro prestazioni sono spesso subottimali nelle PLHIV, potenzialmente a causa del predominio dei geni stimolati dall'interferone (ISG) guidati dalla viremia da HIV o da infezioni opportunistiche. Inoltre, l'interazione iniziale patogeno-ospite avviene nelle alte vie respiratorie, eppure l'analisi trascrittomica dei campioni nasali non è stata esplorata per la diagnosi della TB. Questo studio affronta il vuoto nella comprensione dei profili di espressione genica dell'ospite nella mucosa nasale delle PLHIV con TB attiva rispetto a quelle senza.

Metodologia
Lo studio ha arruolato 40 adulti naïve alla ART in Uganda con diagnosi recente di HIV e sintomi presuntivi di TB (tosse, febbre, sudorazione notturna, perdita di peso). I partecipanti sono stati classificati in due gruppi in base ai risultati di Sputum Xpert MTB/RIF Ultra: 20 con malattia da TB attiva confermata e 20 senza TB (controlli). I criteri di esclusione comprendevano precedente trattamento per TB, fumo attuale o pregresso, diabete, malnutrizione grave o uso recente di antibiotici/corticosteroidi.

• Raccolta dei Campioni: Le cellule nasali sono state raccolte tramite spazzola citologica dalla parete nasale laterale, e il sangue è stato prelevato in tubi PAXgene RNA. I campioni sono stati raccolti prima dell'inizio del trattamento per TB o HIV.
• Sequenziamento dell'RNA: L'RNA totale è stato estratto, il RNA ribosomiale è stato rimosso (deplezione) e le librerie sono state preparate per il sequenziamento Illumina NovaSeq (paired-end 150 bp).
• Bioinformatica: I dati grezzi sono stati sottoposti a controllo qualità (FastQC, Trimmomatic) e allineamento al genoma umano (GRCh38) tramite STAR. L'analisi dell'espressione genica differenziale (DEG) è stata eseguita con DESeq2, identificando geni con un valore p aggiustato < 0,05 e log2 fold-change ≥ 1.
• Machine Learning: Sei algoritmi di apprendimento automatico supervisionato (Random Forest, SVM con kernel radiali/lineari, Elastic Net, PLS, KNN) sono stati addestrati sui set di DEG per classificare lo stato di TB. Le prestazioni sono state valutate tramite cross-validazione a 10 pieghe ripetuta 10 volte, riportando l'Area Sotto la Curva (AUC), la sensibilità e la specificità.
• Analisi dei Percorsi e delle Cellule: GSEA (Gene Set Enrichment Analysis), ORA (Over-Representation Analysis) e IPA (Ingenuity Pathway Analysis) sono stati utilizzati per identificare i percorsi biologici arricchiti. La composizione delle cellule immunitarie è stata stimata utilizzando la matrice di firma LM22 di CIBERSORTx.
• Validazione: Lo studio ha valutato le prestazioni di 59 firme basate sul sangue pubblicate sul dataset nasale e le ha confrontate con il dataset ematico.

Risultati Chiave

• Espressione Genica Differenziale: Lo studio ha identificato 44 geni espressi differenzialmente (DEG) nei campioni nasali e 238 DEG nei campioni di sangue tra i gruppi TB e di controllo. Solo tre geni si sovrapponevano tra i due tipi di campione. Significativamente, la maggior parte dei DEG nasali era sottoregolata nel gruppo TB, mentre la maggior parte dei DEG ematici era sovraregolata.
• Prestazioni Diagnostiche: I modelli addestrati sui 44 DEG nasali hanno raggiunto un'AUC di cross-validazione compresa tra 0,87 e 0,90. I modelli addestrati sui 238 DEG ematici hanno raggiunto un'AUC tra 0,89 e 0,98. Un modello Random Forest sui dati nasali ha ottenuto l'AUC più elevata (0,90).
• Firma Semplificata: È stata identificata una firma nasale parsimoniosa a quattro geni (SPIB, SHISA2, TESPA1 e CD1B) basata sull'importanza della variabile in tutti i modelli. Questa firma ha raggiunto un'AUC di 0,87–0,94, con cinque dei sei modelli che soddisfano i criteri dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per un test di triage della TB (>90% di sensibilità e >70% di specificità).
• Divergenza dei Percorsi: L'analisi dei percorsi ha rivelato risposte immunitarie opposte. Nei campioni nasali, i percorsi relativi al sistema immunitario innato, alla risposta infiammatoria, alla segnalazione dell'interferone (IFN-γ), alla degranulazione dei neutrofili e alla segnalazione delle chemochine erano significativamente sottoregolati in presenza di TB. Al contrario, nei campioni di sangue, questi stessi percorsi erano sovraregolati.
• Firme Pubblicate: Solo 6 delle 59 firme basate sul sangue e pubblicate hanno performato bene (AUC ≥ 0,7) nel dataset nasale, mentre 41–44 hanno performato bene nel dataset ematico, evidenziando la natura distinta del trascrittoma nasale nella TB.
• Composizione Cellulare: Mentre non sono state trovate differenze significative nelle proporzioni delle cellule immunitarie nasali tra i gruppi, i campioni di sangue hanno mostrato una maggiore proporzione di neutrofili e una minore quantità di cellule natural killer nel gruppo TB.

Significato e Rivendicazioni
Gli autori presentano questo lavoro come uno studio di prova di concetto che dimostra l'esistenza di profili di espressione genica nasale distinti associati alla TB che non sono catturati nel sangue. Lo studio afferma che:

1. Nuovi Biomarcatori: La trascrittomica nasale può identificare firme dell'ospite per la TB che differiscono fondamentalmente dalle risposte sistemiche (sangue), mostrando specificamente una risposta immunitaria mucosa locale attenuata (sottoregolazione dell'immunità innata) concomitante a un'infiammazione sistemica.
2. Potenziale Diagnostico: Le firme geniche nasali identificate, in particolare il pannello a quattro geni, mostrano promessa come biomarcatori diagnostici non basati sull'espettorato che soddisfano i criteri di triage dell'OMS.
3. Valore Complementare: Il fatto che i modelli nasali abbiano classificato correttamente i casi di TB persi dai modelli ematici (e viceversa) suggerisce un potenziale valore nell'unire biomarcatori nasali ed ematici per migliorare l'accuratezza diagnostica.
4. Fattibilità: Lo studio stabilisce la fattibilità dell'uso di campioni nasali minimamente invasivi per l'analisi trascrittomica in una popolazione ad alta incidenza e difficile da diagnosticare (PLHIV naïve alla ART).

Gli autori dichiarano esplicitamente che è necessaria un'ulteriore validazione in coorti più ampie, indipendenti e geograficamente distinte prima dell'applicazione clinica. Notano inoltre i limiti, tra cui l'uso di Sputum Ultra come standard di riferimento (che potenzialmente perde i casi paucibacillari), la dimensione ridotta del campione che impedisce divisioni di validazione esterna, e l'impossibilità di regolare per tutti i potenziali confondenti come la colonizzazione nasofaringea.