Nasal Gene Expression in ART-Naive Adults with HIV and Pulmonary Tuberculosis in Uganda

Resumo Técnico: Expressão Gênica Nasal em Adultos Naive à TARV com HIV e Tuberculose Pulmonar em Uganda

Definição do Problema
O diagnóstico da tuberculose (TB) pulmonar em pessoas vivendo com HIV (PVVIH) continua sendo um desafio crítico, particularmente em populações naive à terapia antirretroviral (TARV). As PVVIH frequentemente apresentam doença paucibacilar e dificuldade de expectoração de escarro, o que limita a eficácia dos diagnósticos padrão baseados em escarro, como cultura ou Xpert MTB/RIF Ultra. Embora biomarcadores de mRNA baseados em sangue tenham mostrado promessa como testes de triagem, seu desempenho é frequentemente subótimo em PVVIH, potencialmente devido ao domínio de genes estimulados por interferon (ISGs) impulsionados pela viremia do HIV ou infecções oportunistas. Além disso, a interação inicial patógeno-hospedeiro na TB ocorre nas vias aéreas superiores, contudo, a análise transcriptômica de amostras nasais não foi explorada para o diagnóstico da TB. Este estudo aborda a lacuna na compreensão dos perfis de expressão gênica do hospedeiro na mucosa nasal de PVVIH com TB ativa em comparação com aquelas sem a doença.

Metodologia
O estudo recrutou 40 adultos own-naive à TARV em Uganda com diagnóstico recente de HIV e sintomas de TB presumida (tosse, febre, suores noturnos, perda de peso). Os participantes foram classificados em dois grupos com base nos resultados de escarro Xpert MTB/RIF Ultra: 20 com doença de TB ativa confirmada e 20 sem TB (controles). Os critérios de exclusão incluíram tratamento prévio para TB, tabagismo atual/pregressos, diabetes, desnutrição grave ou uso recente de antibióticos/corticosteroides.

• Coleta de Amostras: Células nasais foram coletadas via escova de citologia da parede nasal lateral, e o sangue foi coletado em tubos PAXgene RNA. As amostras foram coletadas antes do início do tratamento para TB ou HIV.
• Sequenciamento de RNA: O RNA total foi extraído, o RNA ribossômico foi depletado e as bibliotecas foram preparadas para sequenciamento Illumina NovaSeq (paired-end 150 bp).
• Bioinformática: Os dados brutos passaram por controle de qualidade (FastQC, Trimmomatic) e alinhamento ao genoma humano (GRCh38) usando STAR. A análise de expressão diferencial de genes (DEG) foi realizada usando DESeq2, identificando genes com p-valor ajustado < 0,05 e log2 fold-change ≥ 1.
• Aprendizado de Máquina: Seis algoritmos de aprendizado de máquina supervisionado (Random Forest, SVM com kernels radial/linear, Elastic Net, PLS, KNN) foram treinados nos conjuntos de DEGs para classificar o status de TB. O desempenho foi avaliado por meio de validação cruzada de 10 dobras repetida 10 vezes, relatando a Área Sob a Curva (AUC), sensibilidade e especificidade.
• Análise de Vias e Celular: Análise de Enriquecimento de Conjunto de Genes (GSEA), Análise de Sobre-representação (ORA) e Análise de Via de Ingenuity (IPA) foram utilizadas para identificar vias biológicas enriquecidas. A composição de células imunes foi estimada usando o método CIBERSORTx com a matriz de assinatura LM22.
• Validação: O estudo avaliou o desempenho de 59 assinaturas de TB baseadas em sangue publicadas no conjunto de dados nasal e as comparou com o conjunto de dados de sangue.

Principais Resultados

• Expressão Diferencial de Genes: O estudo identificou 44 genes diferencialmente expressos (DEGs) em amostras nasais e 238 DEGs em amostras de sangue entre os grupos TB e controle. Apenas três genes se sobrepuseram entre os dois tipos de amostra. Notavelmente, a maioria dos DEGs nasais estava subexpressa (downregulated) na TB, enquanto a maioria dos DEGs sanguíneos estava superexpressa (upregulated).
• Desempenho Diagnóstico: Modelos treinados nos 44 DEGs nasais alcançaram uma AUC de validação cruzada entre 0,87 e 0,90. Modelos treinados nos 238 DEGs sanguíneos alcançaram uma AUC entre 0,89 e 0,98. Um modelo Random Forest nos dados nasais alcançou a maior AUC (0,90).
• Assinatura Simplificada: Uma assinatura nasal parcimoniosa de quatro genes (SPIB, SHISA2, TESPA1 e CD1B) foi identificada com base na importância da variável em todos os modelos. Esta assinatura alcançou uma AUC de 0,87–0,94, com cinco de seis modelos atendendo aos critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS) para um teste de triagem de TB (>90% de sensibilidade e >70% de especificidade).
• Divergência de Vias: A análise de vias revelou respostas imunes opostas. Nas amostras nasais, as vias relacionadas ao sistema imune inato, resposta inflamatória, sinalização de interferon (IFN-γ), desgranulação de neutrófilos e sinalização de quimiocinas foram significativamente subexpressas na TB. Inversamente, nas amostras de sangue, essas mesmas vias estavam superexpressas.
• Assinaturas Publicadas: Apenas 6 das 59 assinaturas de TB baseadas em sangue performaram bem (AUC ≥ 0,7) no conjunto de dados nasal, enquanto 41–44 performaram bem no conjunto de dados de sangue, destacando a natureza distinta do transcriptoma nasal na TB.
• Composição Celular: Embora não tenham sido encontradas diferenças significativas nas proporções de células imunes nasais entre os grupos, as amostras de sangue mostraram uma proporção maior de neutrófilos e menor de células natural killer no grupo TB.

Significância e Alegações
Os autores apresentam este trabalho como um estudo de prova de conceito demonstrando que existem padrões distintos de expressão gênica nasal associados à TB e que estes não são capturados no sangue. O estudo afirma que:

1. Novos Biomarcadores: A transcriptômica nasal pode identificar assinaturas de hospedeiro para TB que diferem fundamentalmente das respostas sistêmicas (sangue), especificamente mostrando uma resposta imune mucosa local atenuada (subexpressão da imunidade inata) concomitante com a inflamação sistêmica.
2. Potencial Diagnóstico: As assinaturas de genes nasais identificadas, particularmente o painel de quatro genes, mostram promessa como biomarcadores diagnósticos não baseados em escarro que atendem aos critérios de triagem da OMS.
3. Valor Complementar: A descoberta de que os modelos nasais classificaram corretamente casos de TB perdidos pelos modelos de sangue (e vice-versa) sugere valor potencial na combinação de biomarcadores nasais e sanguíneos para melhorar a precisão diagnóstica.
4. Viabilidade: O estudo estabelece a viabilidade do uso de amostras nasais minimamente invasivas para análise transcriptômica em uma população de alta carga e difícil diagnóstico (PVVIH naive à TARV).

Os autores declaram explicitamente que validações adicionais em coortes maiores, independentes e geograficamente distintas são necessárias antes da aplicação clínica. Eles também observam limitações, incluindo a dependência do escarro Ultra como padrão de referência (potencialmente perdendo casos paucibacilares), o tamanho reduzido da amostra que impediu divisões de validação externa, e a incapacidade de ajustar para todos os potenciais confundidores, como a colonização nasofaríngea.