Nasal Gene Expression in ART-Naive Adults with HIV and Pulmonary Tuberculosis in Uganda

Resumen Técnico: Expresión Génica Nasal en Adultos Naive a la TARV con VIH y Tuberculosis Pulmonar en Uganda

Planteamiento del Problema
El diagnóstico de la tuberculosis (TB) pulmonar en personas que viven con el VIH (PVVIH) sigue siendo un desafío crítico, particularmente en poblaciones naive a la terapia antirretroviral (TARV). Las PVVIH suelen presentar enfermedad paucibacilaria y dificultad para expectorar esputo, lo que limita la eficacia de los diagnósticos estándar basados en esputo, como el cultivo o el Xpert MTB/RIF Ultra. Aunque los biomarcadores de ARNm en sangre han mostrado ser prometedores como pruebas de triaje, su rendimiento es a menudo subóptimo en PVVIH, potencialmente debido al predominio de genes estimulados por interferón (ISE) impulsados por la viremia del VIH o infecciones oportunistas. Además, la interacción inicial patógeno-huésped en la TB ocurre en las vías respiratorias superiores; sin embargo, el análisis transcriptómico de las muestras nasales no ha sido explorado para el diagnóstico de la TB. Este estudio aborda la brecha en la comprensión de los perfiles de expresión génica del huésped en la mucosa nasal de PVVIH con TB activa en comparación con aquellas que no la presentan.

Metodología
El estudio reclutó a 40 adultos en Uganda, naive a la TARV, con diagnóstico reciente de VIH y síntomas presuntivos de TB (tos, fiebre, sudores nocturnos, pérdida de peso). Los participantes fueron clasificados en dos grupos basados en los resultados de Xpert MTB/RIF Ultra en esputo: 20 con enfermedad de TB activa confirmada y 20 sin TB (controles). Los criterios de exclusión incluyeron tratamiento previo para TB, tabaquismo actual o pasado, diabetes, desnutrición grave o uso reciente de antibióticos/corticosteroides.

• Recolección de Muestras: Se recolectaron células nasales mediante un cepillo de citología de la pared lateral nasal, y se extrajo sangre en tubos PAXgene RNA. Las muestras se recolectaron antes del inicio del tratamiento para TB o VIH.
• Secuenciación de ARN: El ARN total fue extraído, el ARN ribosomal fue depletado y las librerías se prepararon para la secuenciación Illumina NovaSeq (paired-end 150 bp).
• Bioinformática: Los datos brutos pasaron por un control de calidad (FastQC, Trimmomatic) y alineación al genoma humano (GRCh38) utilizando STAR. El análisis de expresión diferencial de genes (DEG) se realizó mediante DESeq2, identificando genes con un valor de p ajustado < 0.05 y un log2 fold-change ≥ 1.
• Aprendizaje Automático (Machine Learning): Se entrenaron seis algoritmos de aprendizaje automático supervisado (Random Forest, SVM con kernels radial/lineal, Elastic Net, PLS, KNN) utilizando los conjuntos de DEG para clasificar el estado de TB. El rendimiento se evaluó mediante validación cruzada de 10 pliegues (10-fold cross-validation) repetida 10 veces, reportando el Área Bajo la Curva (AUC), sensibilidad y especificidad.
• Análisis de Vías y Celular: Se utilizaron GSEA (Análisis de Enriquecimiento de Conjuntos de Genes), ORA (Análisis de Sobre-representación) e IPA (Análisis de Vías de Ingenuity) para identificar vías biológicas enriquecidas. La composición de células inmunes se estimó mediante CIBERSORTx con la matriz de firma LM22.
• Validación: El estudio evaluó el rendimiento de 59 firmas de TB basadas en sangre publicadas en el conjunto de datos nasales y comparó los resultados con el conjunto de datos de sangre.

Resultados Clave

• Expresión Diferencial de Genes: El estudio identificó 44 genes diferencialmente expresados (DEGs) en muestras nasales y 238 DEGs en muestras de sangre entre los grupos de TB y control. Solo tres genes se solaparon entre ambos tipos de muestras. Notablemente, la mayoría de los DEGs nasales estaban regulados a la baja (downregulated) en la TB, mientras que la mayoría de los DEGs en sangre estaban regulados al alza (upregulated).
• Rendimiento Diagnóstico: Los modelos entrenados con los 44 DEGs nasales lograron un AUC de validación cruzada entre 0.87 y 0.90. Los modelos entrenados con los 238 DEGs de sangre lograron un AUC entre 0.89 y 0.98. Un modelo de Random Forest en datos nasales alcanzó el AUC más alto (0.90).
• Firma Simplificada: Se identificó una firma nasal parsimoniosa de cuatro genes (SPIB, SHISA2, TESPA1 y CD1B) basada en la importancia de la variable a través de todos los modelos. Esta firma logró un AUC de 0.87–0.94, con cinco de los seis modelos cumpliendo con los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para una prueba de triaje de TB (>90% de sensibilidad y >70% de especificidad).
• Divergencia de Vías: El análisis de vías reveló respuestas inmunes opuestas. En las muestras nasales, las vías relacionadas con el sistema inmune innato, la respuesta inflamatoria, la señalización de interferón (IFN-γ), la degranulación de neutrófilos y la señalización de quimiocinas se vieron significativamente disminuidas (downregulated) en la TB. Por el contrario, en las muestras de sangre, estas mismas vías estaban aumentadas (upregulated).
• Firmas Publicadas: Solo 6 de las 59 firmas de TB basadas en sangre funcionaron bien (AUC ≥ 0.7) en el conjunto de datos nasales, mientras que 41–44 funcionaron bien en el conjunto de datos de sangre, lo que resalta la naturaleza distinta del transcriptoma nasal en la TB.
• Composición Celular: Aunque no se encontraron diferencias significativas en las proporciones de células inmunes nasales entre los grupos, las muestras de sangre mostraron una mayor proporción de neutrófilos y un menor número de células Natural Killer en el grupo con TB.

Significancia y Reivindicaciones
Los autores presentan este trabajo como un estudio de prueba de concepto que demuestra que existen patrones de expresión génica nasales distintos asociados con la TB y que estos no se capturan en la sangre. El estudio afirma que:

1. Biomarcadores Novedosos: La transcriptómica nasal puede identificar firmas de la respuesta del huésped para la TB que difieren fundamentalmente de las respuestas sistémicas (sangre), específicamente mostrando una respuesta inmunitaria mucosa local atenuada (regulación a la baja de la inmunidad innata) concurrente con la inflamación sistémica.
2. Potencial Diagnóstico: Las firmas de expresión génica nasales identificadas, particularmente el panel de cuatro genes, muestran promesa como biomarcadores diagnósticos no basados en esputo que cumplen con los criterios de triaje de la OMS.
3. Valor Complementario: El hallazgo de que los modelos nasales clasificaron correctamente los casos de TB perdidos por los modelos de sangre (y viceversa) sugiere un valor potencial para combinar biomarcadores nasales y de sangre para mejorar la precisión diagnóstica.
4. Factibilidad: El estudio establece la factibilidad del uso de muestras nasales mínimamente invasivas para el análisis transcriptómico en una población de alta carga y difícil diagnóstico (PVVIH naive a la TARV).

Los autores declaran explícitamente que se requiere una validación adicional en cohortes más grandes, independientes y geográficamente distintas antes de su aplicación clínica. También señalan limitaciones, incluyendo la dependencia de Xpert Ultra en esputo como el estándar de referencia (que potencialmente pierde casos paucibacilares), el tamaño de muestra reducido que impide divisiones de validación externa, y la incapacidad de ajustar para todos los posibles factores de confusión como la colonización nasofaríngea.