Establishment of long-term callus cultures of Deguelia duckeana (Fabaceae) with sustained production of lupane-type triterpenes

Le piante sono i chimici più sofisticati della natura, costantemente impegnate a fabbricare molecole complesse per difendersi, attirare gli impollinatori o sopravvivere ad ambienti ostili. Per secoli, l'uomo ha raccolto queste piante per estrarre medicinali, coloranti e fragranze, ma questa dipendenza dalle popolazioni selvatiche comporta un costo pesante. Quando una specie è rara o cresce lentamente, la domanda dei suoi composti chimici può minacciarne la stessa esistenza. Per risolvere questo problema, gli scienziati si sono rivolti a una tecnica chiamata coltura tissutale vegetale. Questo metodo consiste nel prendere un piccolo pezzo di una pianta, come una foglia, e farla crescere in un ambiente di laboratorio sterile. Sotto le giuste condizioni, queste cellule possono moltiplicarsi in una massa di tessuto indifferenziato nota come callo. La speranza è che questo tessuto coltivato in laboratorio continui a produrre le stesse sostanze chimiche preziose della pianta originale, offrendo una fonte rinnovabile che non richieda di abbattere foreste o esaurire le popolazioni naturali. Tuttavia, una grande incertezza è rimasta a lungo sospesa su questo approccio: se queste cellule vengono mantenute in vita e in divisione in un barattolo per molti anni, dimenticano come produrre le sostanze chimiche specifiche per cui sono nate, o cambiano completamente la loro ricetta chimica?

Un team di ricercatori presso l'Istituto Nazionale di Ricerca Amazzonica in Brasile si è posto l'obiettivo di rispondere a questa domanda utilizzando una vite specifica nota come Deguelia duckeana. Questa pianta è nativa della foresta pluviale amazzonica ed è nota per contenere una varietà di composti bioattivi, inclusi sostanze che hanno mostrato promesse nel combattere batteri e cancro. La sfida era che, sebbene la pianta fosse stata studiata in natura, nessuno era mai riuscito a coltivarla con successo in un ambiente di laboratorio, né nessuno aveva testato se la sua produzione chimica sarebbe rimasta stabile nel tempo. I ricercatori hanno iniziato raccogliendo foglie giovani della vite nell'Amazzonia. Il loro primo ostacolo è stato semplicemente far crescere il materiale vegetale senza che venisse sopraffatto da batteri e funghi, che prosperano nel clima umido della foresta pluviale. Dopo aver testato ventuno diversi metodi di pulizia che coinvolgevano varie combinazioni di fungicidi, alcol e candeggina, hanno trovato una sequenza specifica che funzionava meglio: un lungo ammollo in un fungicida, seguito da un breve tuffo nell'alcol e un risciacquo finale in una leggera soluzione di candeggina. Questo processo ha permesso loro di stabilire colture pulite e vive a partire dalle foglie.

Una volta stabilite le colture, gli scienziati dovevano incoraggiare i pezzi di foglia a trasformarsi nelle masse di cellule in crescita, o calli, che avrebbero servito come fabbrica per i composti chimici. Posero i pezzi di foglia sterili in un gel ricco di nutrienti e aggiunsero diverse miscele di ormoni vegetali per vedere quale combinazione innescasse la crescita maggiore. Scoprirono che una specifica miscela di tre ormoni produceva i risultati migliori, facendo sì che il settantacinco per cento dei pezzi di foglia si trasformasse in calli sani e di colore verde chiaro entro due settimane. Questi calli furono poi coltivati e divisi ripetutamente per un periodo di dodici anni. Durante questo tempo, i ricercatori eseguirono ottantatré trasferimenti separati del tessuto in nuovi contenitori, un processo necessario per mantenere le cellule vive e in crescita. Questa lunga durata era cruciale, poiché permise al team di osservare se le cellule avrebbero eventualmente perso la capacità di produrre le sostanze chimiche caratteristiche della pianta o se sarebbero rimaste costanti.

Per controllare cosa stessero producendo le cellule, i ricercatori hanno periodicamente raccolto piccole quantità di tessuto e ne hanno analizzato la composizione chimica. Hanno utilizzato un metodo chiamato cromatografia su strato sottile, che separa le sostanze chimiche su una piastra piatta per mostrare cosa è presente, e la risonanza magnetica nucleare, uno strumento potente che rivela l'esatta struttura delle molecole. I risultati furono sorprendentemente coerenti. Durante l'intero periodo di dodici anni, i calli continuarono a produrre un gruppo specifico di composti noti come triterpeni di tipo lupano. Questi includevano tre molecole specifiche: lupeolo, betulaldeide e acido betulinico. Queste sono le stesse tipologie di composti presenti in altre piante correlate e sono note per le loro potenziali proprietà medicinali. Il profilo chimico del tessuto non ha subito derive o cambiamenti; le cellule producevano la stessa miscela di sostanze chimiche nel primo anno come nel dodicesimo. Questa stabilità suggerisce che le cellule abbiano mantenuto le loro istruzioni genetiche e la loro capacità di sintetizzare queste molecole complesse nonostante siano state rimosse dal loro ambiente naturale e tenute in un barattolo per più di un decennio.

I risultati offrono un passo avanti significativo per la conservazione e l'uso delle piante amazzoniche. La popolazione originale di Deguelia duckeana da cui sono state raccolte le foglie nel 2012 è da allora diventata difficile da localizzare a causa dello sviluppo urbano nell'area. Poiché i ricercatori sono stati in grado di mantenere una cultura viva della pianta per così tanto tempo, hanno preservato una risorsa biologica che altrimenti sarebbe potuta andare perduta. Questo studio dimostra che è possibile creare una fonte sostenibile e a lungo termine di preziosi composti vegetali senza fare affidamento sulla popolazione selvatica. Le colture di laboratorio si sono dimostrate una fabbrica stabile, producendo costantemente i composti desiderati anno dopo anno. Questo approccio fornisce un modo per studiare e utilizzare il potenziale chimico di rare specie amazzoniche riducendo al contempo la pressione sulla foresta pluviale stessa, garantendo che queste risorse naturali rimangano disponibili per la futura esplorazione scientifica e il potenziale uso medico.