Establishment of long-term callus cultures of Deguelia duckeana (Fabaceae) with sustained production of lupane-type triterpenes

Planten zijn de meest geavanceerde chemici van de natuur; ze produceren voortdurend complexe moleculen om zichzelf te verdedigen, bestuivers aan te trekken of te overleven in barre omgevingen. Eeuwenlang hebben mensen deze planten geoogst om medicijnen, kleurstoffen en geuren te extraheren, maar deze afhankelijkheid van wilde populaties brengt een zware prijs met zich mee. Wanneer een soort zeldzaam is of langzaam groeit, kan de vraag naar de chemische verbindingen ervan de existentie ervan bedreigen. Om dit op te lossen, hebben wetenschappers zich gericht op een techniek genaamd plantenweefselkweek. Deze methode houdt in dat men een klein stukje van een plant neemt, zoals een blad, en dit laat groeien in een steriele laboratoriumomgeving. Onder de juiste omstandigheden kunnen deze cellen vermenigvuldigen tot een massa ongedifferentieerd weefsel, bekend als een callus. De hoop is dat dit in het laboratorium gekweekte weefsel dezelfde waardevolle chemicaliën zal blijven produceren als de oorspronkelijke plant, wat een hernieuwbare bron biedt die geen kap van bossen of uitputting van natuurlijke populaties vereist. Er heeft echter lang een grote onzekerheid over deze aanpak gehangen: als deze cellen vele jaren lang in leven worden gehouden en in een potje blijven delen, vergeten ze dan hoe ze de specifieke chemicaliën moeten maken waarvoor ze geboren zijn, of veranderen ze hun chemische recept volledig?

Een team van onderzoekers aan het Nationaal Instituut voor Amazonisch Onderzoek in Brazilië begon deze vraag te beantwoorden met behulp van een specifieke klimplant die bekend staat als Deguelia duckeana. Deze plant is inheems in het Amazone regenwoud en staat bekend om het bevatten van een verscheidenheid aan bioactieve verbindingen, waaronder stoffen die veelbelovend zijn gebleken bij de bestrijding van bacteriën en kanker. De uitdaging was dat hoewel de plant in het wild was bestudeerd, nog nooit iemand het succesvol in een laboratoriumsetting had gekweekt, noch had iemand getest of de chemische productie stabiel zou blijven over de tijd. De onderzoekers begonnen met het verzamelen van jonge bladeren van de klimplant in de Amazone. Hun eerste hindernis was simpelweg het laten groeien van het plantmateriaal zonder dat het werd overgenomen door bacteriën en schimmels, die gedijen in het vochtige regenwoudklimaat. Na het testen van eenentwintig verschillende reinigingsmethoden met diverse combinaties van fungiciden, alcohol en bleekmiddel, vonden zij een specifieke sequentie die het beste werkte: een langdurige week in een fungicide, gevolgd door een korte onderdompeling in alcohol en een laatste spoeling in een milde bleekoplossing. Dit proces stelde hen in staat om schone, levende culturen uit de bladeren te vestigen.

Zodode de culturen waren gevestigd, moesten de wetenschappers de bladstukjes stimuleren om te veranderen in de groeiende celmassa's, of callussen, die als de fabriek voor de chemicaliën zouden dienen. Ze plaatsten de steriele bladstukjes in een voedselrijke gel en voegden verschillende mengsels van plantenhormonen toe om te zien welke combinatie de meeste groei zou triggeren. Ze ontdekten dat een specifieke blend van drie hormonen de beste resultaten gaf, wat veroorzaakte dat vijfenzeventig procent van de bladstukjes binnen twee weken veranderde in gezonde, lichtgroene callussen. Deze callussen werden vervolgens gedurende een periode van twaalf jaar herhaaldelijk gekweekt en verdeeld. Tijdens deze periode voerden de onderzoekers drieëndertig afzonderlijke transfers van het weefsel naar verse containers uit, een proces dat noodzakelijk is om de cellen in leven te houden en te laten groeien. Deze lange duur was cruciaal, omdat het het team de mogelijkheid bood om te observeren of de cellen uiteindelijk hun vermogen zouden verliezen om de kenmerkende chemicaliën van de plant te produceren of dat ze consistent zouden blijven.

Om te controleren wat de cellen maakten, oogstten de onderzoekers periodiek kleine hoeveelheden van het weefsel en analyseerden de chemische samenstelling. Ze gebruikten een methode genaamd dunneplaatchromatografie, die chemicaliën op een platte plaat scheidt om te tonen wat aanwezig is, en kernspinresonantie, een krachtig instrument dat de exacte structuur van moleculen onthult. De resultaten waren opmerkelijk consistent. Gedurende de gehele twaalfjarige periode bleven de callussen een specifieke groep verbindingen produceren die bekend staan als lupaan-type triterpenen. Dit omvatte drie specifieke moleculen: lupeol, betulaldehyde en betulinezuur. Dit zijn dezelfde soorten verbindingen die in andere verwante planten worden gevonden en bekend staan om hun potentiële medicinale eigenschappen. Het chemische profiel van het weefsel week niet af en veranderde niet; de cellen produceerden dezelfde mix van chemicaliën in het eerste jaar als in het twaalfde jaar. Deze stabiliteit suggereert dat de cellen hun genetische instructies en hun vermogen om deze complexe moleculen te synthetiseren hebben behouden, ondanks dat ze uit hun natuurlijke omgeving zijn gehaald en meer dan een decennium in een potje zijn gehouden.

De bevindingen vormen een belangrijke stap voor de conservering en het gebruik van Amazonische planten. De oorspronkelijke populatie van Deguelia duckeana, waaruit de bladeren in 2012 werden verzameld, is sindsdien moeilijk te lokaliseren door stedelijke ontwikkeling in het gebied. Omdat de onderzoekers erin slaagden een levende cultuur van de plant zo lang te onderhouden, hebben zij een biologische bron bewaard die anders wellicht verloren zou zijn gegaan. Deze studie demonstreert dat het mogelijk is om een duurzame, langdurige bron van waardevolle plantenchemische stoffen te creëren zonder afhankelijk te zijn van de wilde populatie. De laboratoriumculturen bleken een stabiele fabriek te zijn, die jaar na jaar consequent de gewenste verbindingen produceerden. Deze aanpak biedt een manier om het chemische potentieel van zeldzame Amazonische soorten te bestuderen en te benutten, terwijl de druk op het regenwoud zelf wordt verminderd, waardoor deze natuurlijke hulpbronnen beschikbaar blijven voor toekomstig wetenschappelijk onderzoek en potentieel medisch gebruik.