An in vitro platform for the rapid and scalable biocatalysis of complex polyketides

La natura ha costruito alcune delle fabbriche chimiche più sofisticate conosciute dalla scienza all'interno di minuscoli batteri. Questi organismi microscopici possiedono lunghe linee di montaggio molecolari fatte di proteine che possono incastrare semplici blocchi da costruzione in strutture tridimensionali complesse. Queste strutture, note come polichetidi, sono la fonte di molti medicinali salvavita, inclusi antibiotici che combattono le infezioni e farmaci che calmano il sistema immunitario. Per decenni, gli scienziati hanno sognato di estrarre queste linee di montaggio naturali dai batteri e di collocarle in una provetta. L'idea era quella di far funzionare queste macchine molecolari direttamente, senza l'interferenza disordinata di una cella vivente, per creare nuovi medicinali in modo più rapido e pulito. Tuttavia, i primi tenti di farlo sono falliti. Quando i ricercatori hanno cercato di far funzionare queste linee di montaggio al di fuori della cellula, si muovevano così lentamente che il processo sembrava inutile, producendo quasi nulla prima che il macchinario smettesse di funzionare.

Un team di ricercatori dell'Università del Texas ad Austin ha ora ribaltato questa convinzione di lungo corso. Hanno sviluppato un nuovo modo per far funzionare queste linee di montaggio molecolari in una provetta che è veloce, efficiente e capace di produrre grandi quantità di sostanze chimiche complesse. Riprogettando attentamente le parti proteiche della linea di montaggio e creando un sistema che rifornisce costantemente il carburante di cui le macchine hanno bisogno, il team ha trasformato un processo lento in una linea di produzione rapida. Hanno dimostato che queste macchine biologiche possono lavorare velocemente quanto le fabbriche naturali più efficienti presenti in natura, convertendo ingredienti semplici in molecole complesse simili a farmaci in poche ore. Questa scoperta suggerisce che gli scienziati possono ora costruire librerie di nuovi e complessi medicinali in un ambiente di laboratorio, superando i metodi lenti ed costosi della sintesi chimica tradizionale o la natura imprevedibile della crescita dei batteri.

La storia inizia con un tipo specifico di macchina molecolare chiamato polichetide sintasi. In natura, queste macchine sono come enormi nastri trasportatori fatti di proteine. Prendono piccole e semplici molecole e le collegano tra loro in un ordine preciso per costruire strutture più grandi e intricate. L'ordine delle parti sul nastro determina la forma e la funzione del prodotto finale. Per anni, gli scienziati hanno cercato di usare queste macchine all'interno di batteri viventi per produrre medicinali. Sebbene questo funzionasse, era difficile da controllare. I batteri avevano i propri processi interni che competevano con la linea di montaggio, ed era difficile capire se una bassa resa fosse dovuta a un difetto della macchina o all'ambiente della cella. Spostare il processo in una provetta sembrava la soluzione logica, poiché avrebbe permesso di controllare ogni variabile. Ma quando hanno provato per la prima volta, le macchine erano incredibilmente lente. Un famoso tentativo di far funzionare una macchina che produce un antibiotico chiamato eritromicina mostrò che si muoveva a un ritmo glaciale, producendo solo una piccolissima quantità di prodotto prima di fermarsi. Ciò aveva portato alla diffusa ipotesi che queste macchine complesse semplicemente non funzionassero bene al di fuori della loro dimora naturale.

I ricercatori si sono posti l'obiettivo di dimostrare che tale ipotesi era errata. Si sono concentrati su una macchina diversa, una che produce naturalmente un composto chiamato narbonolide, che è correlato all'antibiotico pikromicina. Invece di utilizzare la versione naturale della macchina, che è composta da quattro grandi filamenti proteici, l'hanno scomposta in sei pezzi più piccoli e gestibili. Questo design rifattorizzato ha reso più facile produrre la macchina in laboratorio e assemblarla correttamente. Hanno poi testato questa nuova configurazione in una soluzione contenente il carburante e i blocchi da costruzione necessari. Inizialmente, la macchina funzionava, ma era ancora troppo lenta per essere pratica, e il prodotto che creava era fragile, degradandosi nell'ambiente chimico della provetta. Il team si è reso conto che la macchina stava combattendo contro se stessa. Alcune parti della macchina producevano sottoprodotti indesiderati e il carburante veniva sprecato.

Per risolvere il problema, i ricercatori hanno trattato la linea di montaggio come un complesso motore che necessitava di una messa a punto. Hanno sostituito parti specifiche della macchina, rimpiazzando i connettori generici con altri che si adattassero meglio al compito specifico. Hanno spostato le etichette utilizzate per identificare le proteine in altri punti dei filamenti per vedere se questo aiutasse i pezzi ad aderire in modo più efficiente. Hanno anche aggiunto un enzima di pulizia speciale che agiva come un meccanico, rimuovendo le parti difettose che avrebbero altrimenti bloccato la linea di montaggio. Ogni piccola modifica rendeva la macchina più veloce. Al termine dell'ottimizzazione del design, la macchina lavorava a una velocità cento volte superiore rispetto alla vecchia macchina dell'eritromicina e paragonabile alla velocità delle più efficienti fabbriche naturali di acidi grassi presenti in natura. Non era più un esperimento lento; era un biocatalizzatore ad alte prestazioni.

L'ultimo tassello del puzzle era il sistema di carburante. Queste macchine richiedono un costante approvvigionamento di energia e specifici blocchi da costruzione per continuare a muoversi. In una cella vivente, la cella fornisce questo carburante automaticamente. In una provetta, il carburante si esaurisce rapidamente. Il team ha sviluppato una nuova piattaforma, che chiamano sistema EPK, che funge da stazione di rifornimento automatico. Questo sistema include enzimi che rigenerano costantemente il carburante e i blocoli da costruzione partendo da ingredienti semplici e economici. Con questo sistema in funzione, i ricercatori sono riusciti a far avvenire una reazione in un piccolo becher a temperatura ambiente per due ore. Sono partiti con una piccolissima quantità della macchina e ingredienti semplici, e la macchina li ha convertiti in una grande quantità del prodotto finale. In sole due ore, hanno prodotto abbastanza composto di narbonolide da riempire una piccola fiala, una quantità che avrebbe richiesto giorni o settimane con i metodi precedenti.

Il successo di questa piattaforma è andato oltre la produzione di un singolo composto. I ricercatori hanno utilizzato lo stesso sistema ottimizzato per costruire altri quattro molecole complesse, ognuna con una forma leggermente diversa. Poiché il processo era così pulito e privo del "rumore" di una cella vivente, sono stati in grado di isolare questi prodotti in forma pura. Ciò ha permesso loro di determinare l'esatta struttura tridimensionale delle molecole tramite cristallografia a raggi X, rivelando dettagli che non erano mai stati visti prima. Una delle molecole prodotte aveva una struttura che era l'immagine speculare di un composto noto, una sottile differenza che spesso viene persa nelle cellule viventi, ma che qui era chiaramente visibile. La capacità di produrre queste forme complesse in forma pura apre la porta alla creazione di vaste librerie di nuove strutture chimiche. Gli scienziati possono ora mescolare e abbinare diverse parti delle linee di montaggio per creare migliaia di nuove variazioni, testandone le proprietà medicinali senza i vincoli della crescita dei batteri.

Questo lavoro cambia il panorama di come possano essere prodotti i medicinali complessi. Dimostra che la lentezza di queste macchine molecolari non era un difetto fondamentale, ma il risultato di un cattivo design e della mancanza di adeguati sistemi di supporto. Ricostruendo le macchine e fornendo loro un flusso costante di carburante, i ricercatori hanno sbloccato un nuovo modo per sfruttare gli strumenti sintetici più potenti della natura. Il processo è ora abbastanza veloce da essere pratico e abbastanza pulito da produrre materiali di alta qualità per la scoperta di farmaci. Sebbene la tecnologia sia ancora nelle sue fasi iniziali, i risultati dimostrano che il futuro della produzione di medicinali complessi potrebbe non risiedere nel coltivare più batteri o costruire più impianti chimici, ma nel perfezionare le linee di montaggio molecolari che la natura ha già perfezionato. La porta è ora aperta per esplorare un vasto spazio chimico, creando nuove possibilità per trattare malattie che sono state a lungo difficili da raggiungere.